[发明专利]一种从骨髓中提取免疫细胞的方法

说明书

本发明涉及细胞生物学技术领域，具体涉及一种从骨髓中提取免疫细胞的方法，包括如下步骤：（1）采集人骨髓，用含胎牛血清的α‑MEM培养液稀释，离心，弃上清和脂肪层，得到骨髓细胞；（2）将人体外周血移入离心管中，离心，吸取上层血浆备用，下层细胞用于分离外周血淋巴细胞；所述骨髓细胞中加入含所述上层血浆的α‑MEM培养液制成细胞悬液；（3）将分离液加入到离心管中；再将所述细胞悬液平铺到所述分离液上，离心，吸取白膜层细胞获得免疫细胞；（4）将免疫细胞等体积加入到免疫细胞冻存液中混合均匀，冻存。本发明的方法能够有效提高免疫细胞分离率和细胞冻存复苏后的存活率，提高回输到患者的细胞的安全性。

技术领域

本发明涉及细胞生物学技术领域，具体涉及一种从骨髓中提取免疫细胞的方法。

背景技术

骨髓是人重要的免疫器官，含有大量的免疫细胞，在临床应用过程中，常见的问题是很难保证提供足够数量的免疫细胞。目前主要是利用低温冻存技术保存免疫细胞，在需要时复苏并诱导培养为各种免疫细胞。但在分离、冻存过程中，会对单个细胞产生损伤，甚至毒性，尤其是冻存过程中会显著改变细胞的热力学、化学和物理环境，同时伴随生物性损伤的危险。

另一方面，骨髓中含有较多的脂肪，影响分离效果，不能获得足够的免疫细胞，再加上冻存过程中对细胞产生的损伤，使免疫细胞冻存复苏后的存活率不高。细胞冻存复苏后的存活率通常在70％-90％之间。细胞冻存复苏后的存活率可能会受到细胞采集、分离、冻存等过程的影响。因此，为提供足够量的淋巴细胞，现有技术中细胞冻存复苏后的存活率仍需进一步提高，同时也应避免回输给患者时出现恶心、呕吐或过敏等不良反应，提高安全性。现有技术中，常规的Ficoll 400分离液对细胞具有一定的毒性，不利于临床应用。

因此，有必要提供一种能够有效提高免疫细胞分离率和细胞冻存复苏后的存活率、提高回输到患者的细胞的安全性的提取方法。

发明内容

为了克服现有技术中存在的缺点和不足，本发明的目的在于提供一种从骨髓中提取免疫细胞的方法,该方法能够有效提高免疫细胞分离率和细胞冻存复苏后的存活率，提高回输到患者的细胞的安全性。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种从骨髓中提取免疫细胞的方法，包括如下步骤：

（1）采集人骨髓，用含质量分数为10%-14％胎牛血清的α-MEM培养液稀释2-4倍，200-400rpm转速下离心2-4min，弃上清和脂肪层，得到骨髓细胞；

（2）将人体外周血移入离心管中，500-700rpm转速下离心5-9min，吸取上层血浆备用，下层细胞用于分离外周血淋巴细胞；所述骨髓细胞中加入含质量分数为10%-14％所述上层血浆的α-MEM培养液制成细胞悬液；

（3）将分离液加入到离心管中；再将所述细胞悬液平铺到所述分离液上，600-800rpm转速下离心10-20min，吸取白膜层细胞获得免疫细胞；

（4）将免疫细胞等体积加入到免疫细胞冻存液中混合均匀，得到细胞重悬液，将细胞重悬液分装入冻存袋中，再将冻存袋装入冻存袋盒中，进行程序降温至-78～-82℃后转至-196℃液氮罐冻存。

优选的，所述步骤（2）中，细胞悬液的细胞密度为4×10⁵-8×10⁵个/mL。

优选的，所述步骤（3）中，分离液的制备方法为：将符合药用标准的右旋糖酐1-3重量份，海藻糖1-2重量份，超低粘度海藻酸钠1-2重量份，泛影葡胺3-5重量份和聚二烯丙基二甲基氯化铵0.4-0.8重量份充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100重量份，再经过0.22μm滤膜过滤制得分离液。