[发明专利]一种从骨髓中提取免疫细胞的方法

权利要求书

1.一种在体外从骨髓中提取免疫细胞的方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）人骨髓用含质量分数为10%-14％胎牛血清的α-MEM培养液稀释2-4倍，200-400rpm转速下离心2-4min，弃上清和脂肪层，得到骨髓细胞；

（2）将人体外周血移入离心管中，500-700rpm转速下离心5-9min，吸取上层血浆备用，下层细胞用于分离外周血淋巴细胞；所述骨髓细胞中加入含质量分数为10%-14％所述上层血浆的α-MEM培养液制成细胞悬液；

（3）将分离液加入到离心管中；再将所述细胞悬液平铺到所述分离液上，600-800rpm转速下离心10-20min，吸取白膜层细胞获得免疫细胞；

（4）将免疫细胞等体积加入到免疫细胞冻存液中混合均匀，得到细胞重悬液，将细胞重悬液分装入冻存袋中，再将冻存袋装入冻存袋盒中，进行程序降温至-78～-82℃后转至-196℃液氮罐冻存；

所述步骤（4）中，免疫细胞冻存液包括如下组分：

二甲基亚砜 4-8mL

右旋糖酐 2-6mL

细胞培养基 10-30mL

人血清白蛋白 1-5mL

人自体血浆 60-100mL

糖类 1-3g

非必须氨基酸 0.2-0.6g

维生素C 0.1-0.5g

丙二醇 0.2-0.6mL

聚乙二醇 0.4-0.8mL

重组人白介素 4000-8000U

白酒草皂苷R 0.3-0.7g

勃脉力A 0.8-1.2g

青霉素-链霉素双抗溶液 0.1-0.5mL

氯化钠 0.4-0.8g；

所述糖类是由海藻糖、α-1 ,4-葡聚糖、香菇多糖和葡萄糖以重量比1:0.8-1.2：1.5-2.5：2-4组成的混合物。

2.根据权利要求1所述的一种在体外从骨髓中提取免疫细胞的方法，其特征在于：所述步骤（2）中，细胞悬液的细胞密度为4×10⁵-8×10⁵个/mL。

3.根据权利要求1所述的一种在体外从骨髓中提取免疫细胞的方法，其特征在于：所述步骤（3）中，分离液的制备方法为：将符合药用标准的右旋糖酐1-3重量份，海藻糖1-2重量份，超低粘度海藻酸钠1-2重量份，泛影葡胺3-5重量份和聚二烯丙基二甲基氯化铵0.4-0.8重量份充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100重量份，再经过0.22μm滤膜过滤制得分离液。

4.根据权利要求1所述的一种在体外从骨髓中提取免疫细胞的方法，其特征在于：所述步骤（3）中，分离液的密度为1.050-1.070g/cm³，渗透压为250-270smol/kg，pH为7-8，粘度为1.0-3.0cp。

5.根据权利要求1所述的一种在体外从骨髓中提取免疫细胞的方法，其特征在于：所述步骤（4）中，细胞重悬液的细胞密度为5×10⁶-5×10⁷个/mL。

6.根据权利要求1所述的一种在体外从骨髓中提取免疫细胞的方法，其特征在于：所述步骤（4）中，程序降温先以1-2℃/min的降温速度降温至-23～-27℃，再以5-7℃/min的降温速度降温至-78～-82℃。