[发明专利]一种CIK细胞培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种CIK细胞培养方法。

背景技术

细胞过继免疫治疗是将体外诱导的具有强大杀瘤活性的免疫细胞回输给患者的一种生物治疗方法，其不仅具有杀伤体内残存癌细胞的能力，同时可增强宿主的免疫力，已成为肿瘤生物治疗的重要手段之一。

细胞因子诱导的杀伤细胞（Cytokine induced killer cell，CIK），是将人外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）经多种细胞因子共同培养刺激后所获得的一群异质细胞，其主要效应细胞为CD3⁺ CD56⁺双阳性细胞，兼具有T 淋巴细胞强大的抗瘤活性和非主要组织相容性复合物（MHC）限制性杀瘤的特点。CIK细胞具有增殖速度快、杀瘤活性高、杀瘤谱广、对多重耐药肿瘤细胞同样敏感、对正常骨髓造血前体细胞细胞毒性小等特点，是目前发现的杀伤肿瘤细胞活性强，适合临床应用的一种理想的效应细胞，但这种效应细胞在正常外周血中极其少见，因此CIK细胞被认为是目前抗肿瘤细胞过继免疫治疗的首选方案。

但现有的CIK细胞方法培养的CIK细胞大多存在活性和增殖能力较差的问题。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的上述不足，提供一种简单有效的CIK细胞培养方法，能显著提高免疫细胞的活性和增殖能力，特别是CD3⁺CD56⁺效应细胞的获得数量，提高其杀伤活性。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种CIK细胞培养方法，包括以下步骤：

（1）将外周血单个核细胞在CIK培养液重悬，得到细胞悬液；

（2）将细胞悬液加入到已预先用抗CD3 单克隆抗体和retronectin包被好的培养瓶中，之后置于37℃，5%CO² 饱和湿度培养箱中培养；培养前调整细胞密度为7×10⁵-2×10⁶/mL；

（3）培养的第3天补充CIK培养液；

（4）培养的第6天，补加完CIK培养液后，将培养瓶中的培养液混合物倒分装到不同的培养容器中，进行扩大培养，培养前调整细胞密度为7×10⁵-1.5×10⁶/mL；

（5）培养的第9天补充CIK培养液；

（6）培养至第12-14 天，收获细胞，优选地，培养至第13天收获。

优选地，所述步骤（2）中，培养前抗CD3单抗的终浓度为6μg/mL，retronectin的终浓度为11μg/mL。

优选地，所述CIK培养液包括基础培养基和添加于基础培养基中的添加剂，按终浓度计，所述添加剂包括以下含量的组分：多聚赖氨酸20-30µg/mL、卡介菌多糖核酸5-15mg/mL、亚硒酸钠0.03-0.04μmol/mL、4-羟乙基哌嗪乙磺酸5-8µg/mL、还原型谷胱甘肽2-4μg/mL、腺苷脱氨酶8-12µg/mL、IFN-γ缓释微球2-3mg/mL、IL-2缓释微球1.5-2mg / mL、自体血浆4-6mL/L。

优选地，所述IL-2缓释微球的制备方法包括以下步骤：

A、将IL-2、聚乙二醇加入预先添加有甘露醇和硫酸锌的水溶液中，搅拌均匀后，得到混合物A，所述混合物A中IL-2的浓度为1.2-2.5wt％，聚乙二醇的浓度为7-12 wt％；

B、将聚羟基乙酸-聚乳酸-聚乙二醇加入二氯甲烷中溶解，搅拌均匀后，得到混合物B， 所述混合物B中聚羟基乙酸-聚乳酸-聚乙二醇的浓度为12-18wt％；

C、将混合物A 加入到混合物B 中，搅拌均匀后，得到混合物C ，所述混合物A和混合物B的体积比为1:1-2；

D、将聚乙烯醇、壳聚糖和氯化钠加入水中，搅拌均匀后，得到混合物D；所述混合物D中聚乙烯醇的浓度为1-2 wt %，壳聚糖的浓度为0.5-1 wt %，氯化钠的浓度为1-2 wt %；

E、将混合物C加入混合物D中，搅拌进行溶剂挥发，经洗涤、离心分离、真空冷冻干燥，制得IL-2缓释微球。

优选地，所述IL-2缓释微球的粒径为60-110μm。本发明的IFN-γ缓释微球使缓释微球的包封率大于85%。

优选地，所述混合物A中，所述甘露醇的浓度为2-4 wt％，碳酸锌的浓度为1-3 wt％。

优选地，所述聚乙烯醇由质量比为1:0.5-2的无规聚乙烯醇和间规聚乙烯组成。