[发明专利]一种CIK细胞培养方法

权利要求书

1.一种CIK细胞培养方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）将外周血单个核细胞在CIK培养液重悬，得到细胞悬液；

（2）将细胞悬液加入到已预先用抗CD3 单克隆抗体和retronectin包被好的培养瓶中，之后置于37℃，5%CO² 饱和湿度培养箱中培养；培养前调整细胞密度为7×10⁵-2×10⁶/mL；

（3）培养的第3天补充CIK培养液；

（4）培养的第6天，补加完CIK培养液后，将培养瓶中的培养液混合物倒分装到不同的培养容器中，进行扩大培养，培养前调整细胞密度为7×10⁵-1.5×10⁶/mL；

（5）培养的第9天补充CIK培养液；

（6）培养至第12-14 天，收获细胞。

2.根据权利要求1所述的一种CIK细胞培养方法，其特征在于：所述CIK培养液包括基础培养基和添加于基础培养基中的添加剂，按终浓度计，所述添加剂包括以下含量的组分：多聚赖氨酸20-30µg/mL、卡介菌多糖核酸5-15mg/mL、亚硒酸钠0.03-0.04μmol/mL、4-羟乙基哌嗪乙磺酸5-8µg/mL、还原型谷胱甘肽2-4μg/mL、腺苷脱氨酶8-12µg/mL、IFN-γ缓释微球20-30mg/mL、IL-2缓释微球1.5-2mg / mL、自体血浆4-6mL/L。

3.根据权利要求2所述的一种CIK细胞培养方法，其特征在于：所述IL-2缓释微球的制备方法包括以下步骤：

A、将IL-2、聚乙二醇加入预先添加有甘露醇和硫酸锌的水溶液中，搅拌均匀后，得到混合物A，所述混合物A中IL-2的浓度为1.2-2.5wt％，聚乙二醇的浓度为7-12 wt％；

B、将聚羟基乙酸- 聚乳酸- 聚乙二醇加入二氯甲烷中溶解，搅拌均匀后，得到混合物B， 所述混合物B中聚羟基乙酸- 聚乳酸- 聚乙二醇的浓度为12-18wt％；

C、将混合物A 加入到混合物B 中，搅拌均匀后，得到混合物C ，所述混合物A和混合物B的体积比为1:1-2；

D、将聚乙烯醇、壳聚糖和氯化钠加入水中，搅拌均匀后，得到混合物D；所述混合物D中聚乙烯醇的浓度为1-2 wt %，壳聚糖的浓度为0.5-1 wt %，氯化钠的浓度为1-2 wt %；

E、将混合物C加入混合物D中，搅拌进行溶剂挥发，经洗涤、离心分离、真空冷冻干燥，制得IL-2缓释微球。

4.根据权利要求3所述的一种CIK细胞培养方法，其特征在于：所述IL-2缓释微球的粒径为60-110μm。

5.根据权利要求3所述的一种CIK细胞培养方法，其特征在于：所述混合物A中，所述甘露醇的浓度为2-4 wt％，碳酸锌的浓度为1-3 wt％。

6.根据权利要求3所述的一种CIK细胞培养方法，其特征在于：所述聚乙烯醇由质量比为1:0.5-2的无规聚乙烯醇和间规聚乙烯组成。

7.根据权利要求6所述的一种CIK细胞培养方法，其特征在于：所述无规聚乙烯醇的聚合度为600-1000，所述间规聚乙烯的聚合度为1800-2500。

8.根据权利要求2所述的一种CIK细胞培养方法，其特征在于：所述IFN-γ缓释微球的制备方法包括以下步骤：

S1、将IFN-γ、肝素、聚乙二醇加入预先添加有葡聚糖和季戊四醇锌盐的水溶液，搅拌均匀后，得到混合物Ⅰ，所述混合物A中IFN-γ的浓度为2-5wt％，聚乙二醇的浓度为5-9wt％，肝素的浓度为0.5-1.5wt％；

S2、将聚乳酸- 聚乙二醇加入二氯甲烷中溶解，搅拌均匀后，得到混合物Ⅱ， 所述混合物Ⅱ中聚乳酸-聚乙二醇的浓度为13-20wt％；

S3、将混合物Ⅰ加入到混合物Ⅱ 中，搅拌均匀后，得到混合物Ⅲ ，所述混合物Ⅰ和混合物Ⅱ的体积比为1:1.5-2.5；

S4、将聚乙烯醇、壳聚糖和海藻酸钠加入水中，搅拌均匀后，得到混合物Ⅳ；所述混合物Ⅳ中聚乙烯醇的浓度为1-2 wt %，壳聚糖的浓度为0.5-1 wt %，海藻酸钠的浓度为2-4 wt %；

S5、将混合物Ⅲ加入混合物Ⅳ中，搅拌进行溶剂挥发，经洗涤、离心分离、真空冷冻干燥，制得IFN-γ缓释微球。