[发明专利]一种筛选炎性体NLRP3激活剂及抑制剂的荧光细胞传感器

说明书

本发明公开了一种筛选炎性体NLRP3激活剂及抑制剂的荧光细胞传感器，属于药物筛选技术领域。本发明通过转基因手段构建了一种细胞荧光传感器，将NLRP3启动子核心区与ZSGREEN基因插入质粒载体，转入Thp‑1细胞得到稳转细胞系；该稳转细胞系在接受到NLRP3炎性体的刺激后，会发出绿色荧光，采用宽场成像高内涵捕捉荧光细胞。该荧光传感器可以实现两个目的，第一，快速高效的发现可以引起NLRP3高表达的物质，第二，在NLRP3激活剂的作用下，可以快速高效的发现抑制NLRP3激活的物质。并且，宽场成像高内涵可以高通量的拍摄荧光图像，极大的提高了筛药的效率。本发明方法可以用于以NLRP3炎性体为靶点的药物的初筛，也可以用于对NLRP3炎性体的科学研究。

技术领域

本发明涉及一种筛选炎性体NLRP3激活剂及抑制剂的荧光细胞传感器，属于药物筛选技术领域。

背景技术

炎症是指机体对于外界刺激而利用系统的活体自制对外界致炎因子产生防御的一种十分重要而又常见的病理过程，起基本病变主要表现为组织的变质、渗出和增生，以体表炎症最为典型，其主要特征为患病部位发红、发热、肿胀及局部功能性障碍。正常情况下炎症反应能够清楚外来物质，并使受损组织得以修复和愈合，但在一些病理情况下，例如有害物质持续存在时，炎症反应反应也会导致对自身组织的攻击，甚至促进疾病的发生。常见的炎症类疾病有很多，如哮喘、类风湿性关节炎、动脉粥样硬化、肾小球肾炎、肠胃炎、脓毒症等，另外炎症过程中产生的炎症微环境对肿瘤的发生和转移也具有一定的促进作用。炎症过程中涉及众多细胞因子和炎症介质的分泌、释放，这些炎症因子对炎症过程具有极大的推动作用。研究发现，长期、慢性持续性的炎症是胰岛素抵抗、某些心脑血管疾病、糖尿病、阿兹海默症等慢性疾病的诱因，可是说，炎症相关疾病是困扰人类多年的医学难题。

个体反应的基础是细胞及分子层面的改变，从炎症的细胞基础角度出发，致炎因素通过激活细胞内特定的受体和通路引发炎症因子的释放，如Toll样受体、Nod样受体，炎症因子又反过来继续刺激参与炎症反应的细胞。从细胞和分子层面研究炎症反应有助于我们了解炎症反应的实质，更有助于促使我们发现抗炎药物及其机理。NLRP3是NOD样受体家族的一名成员，属于先天性免疫系统中的模式识别受体，当其被激活后，与接头蛋白ASC和半胱天冬酶-1(Caspase-1)形成复合体，该复合体被称为炎性小体(Inflammasome)3，炎性小体的概念由Tschopp研究小组于2002年首次提出，在自2002至今为止的15年时间中，国际上对于炎性小体的研究成果与数量成指数型增长，而在国内，对于炎性小体相关疾病、原理的研究相对较少，水平落后于国际同领域研究者。在炎性小体NLRP3这个分子平台上，白介素-1β(IL-1β)被剪切成熟而后释放出细胞，炎性小体NLRP3的激活离不开其重要组成部分NLRP3的大量转录和翻译，可以说，NLRP3的大量转录和翻译是炎性小体NLRP3激活并组成聚合体最重要的一步。NLRP3炎性体的激活剂包括病原相关分子模式和毁坏相关分子模式，前者包括脂多糖(LPS)、病毒DNA等，后者则包括三磷酸腺苷(ATP)、β-淀粉样蛋白等。研究发现，在许多炎症相关的疾病中，都存在NLRP3炎性体的激活。以炎性小体为靶点进行药物的筛选是目前抗炎药物研发的发展方向，然而，目前在研究炎性小体3的激活与抑制时，所使用的手段主要是Western、RT-PCR等，这些方法操作繁琐、要求操作者必须具备一定的专业素质，进行一次Western实验通常需要两天时间，抗体等试剂耗材价格昂贵，同一批次处理量少，最多只能操作个位数个样本，显然这样的方法不适合也无法用于NLRP3干预剂的筛选。

细胞是形成有机体形态和功能的基本组成单位，对研究机体结构和探索生命活动具有重要意义。细胞传感技术以活细胞作为探测元件，通过对活细胞的基本生理性质或细胞对被测物的响应进行检测，从而定性定量地确定细胞的生理状态或被检物的含量。因此，细胞传感技术对于研究细胞的结构和功能、探索生命的活动和规律、疾病的诊断和治疗、药物的设计和筛选、食品安全的监督和检测等都具有十分重大的意义。随着生命工程技术的发展与信息技术的飞跃，各学科间的交叉融合，使得细胞传感检测研究得到了飞速发展，新型的纳米材料、荧光及电化学细胞传感器不断问世，极大推动了生物传感技术地迅猛发展。