[发明专利]一种快速鉴别PRRSV疫苗株GDr180株与其他毒株的PCR-HRM检测方法

说明书

本发明公开了一种快速鉴别PRRSV疫苗株GDr180株与其他毒株的PCR‑HRM检测方法。本发明方法操作简单：PCR基础上附带HRM，第一轮PCR常规扩增及第二轮PCR‑HRM反应之前加荧光饱和染料即可；检测速度快且高通量：全部操作过程只需3‑4小时，极大缩短了鉴别所需时间；费用低，寡核苷酸链3’端C3封闭的探针廉价且合成技术成熟，荧光饱和染料种类选择多且用量少；准确性高、特异性好，重复性好，可实现准确、快速、高通量的分析，有利于在临床实践中推广应用。

技术领域

本发明属于病毒检测领域，具体涉及一种快速鉴别猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)疫苗株GDr180株与其他毒株的PCR-HRM检测方法。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合症(Porcine Reproductive and respiratory syndrome，PRRS)最早于1987年发现于美国，其症状主要表现为怀孕母猪流产、早产、产死胎、木乃伊胎及仔猪感染后的成活率下降，成年猪的呼吸道症状。

PRRSV弱毒疫苗株(GDr180)是中国兽医药品监察所最新培育的高代次致弱毒株，具有良好免疫保护力和安全性的疫苗株，临床试验证明该疫苗免疫接种对实验猪具有很好的免疫保护作用。疫苗接种后不会使猪产生体温升高等免疫副反应，降低活疫苗排毒风险。接种后可获得坚强的免疫保护和较长的免疫保护期。GDr180疫苗的研制丰富了我国市场高致病蓝耳疫苗的种类，通过鉴别疫苗株与野毒株可以排除免疫后是疫苗株残毒还是野毒株的感染，是非常有意义的举措。目前较少关于GDr180株与野毒株的鉴别研究，仅有双重荧光定量PCR方法的研究报道，但需要使用较昂贵的MGB荧光探针，成本高。所以，建立一种较简单、经济的鉴别疫苗株与野毒株的方法，具有重大意义。

PCR-高分辨熔解曲线分析技术(high-resolution melting curve analysis，HRM)是一种用于单核苷酸多态性(SNP)和基因分型研究方法，是一种简单、快速、低成本的PCR扩增后检测技术，可用于高通量的突变扫描和基因分型。PCR-HRM实验的难点在于，需要找筛选出合适的靶位点来设计引物，依据靶位点的序列匹配度的差异使得熔解曲线探针峰出现熔解温度的差异来达到区分目的，熔解温度的差异大小即依赖于序列匹配度，同时也与碱基序列种类和排布有关。好的靶序列和合适的PCR扩增条件才能够获得好的熔解曲线区分效果。如果不然，则无法获得有差异的熔解曲线探针峰，无法达到区分的目的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速鉴别PRRSV疫苗株GDr180株与其他毒株的PCR-HRM检测方法的引物及探针；

本发明的另一目的在于提供一种快速鉴别PRRSV疫苗株GDr180株与其他毒株的PCR-HRM检测方法的试剂；

本发明的再一目的在于提供一种快速鉴别PRRSV疫苗株GDr180与其他株的PCR-HRM检测方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种快速鉴别PRRSV疫苗株GDr180株与其他毒株的PCR-HRM检测方法的引物，其核苷酸序列如下所示：

P1:TTCTTCTTGCCTTTTCTATGCTTC；

P2:CAACTGTGTCAAGGAAATGGCT；

P3:CAGGATAGGGCATGACCGAT；

P4:CCAAATATCTCGGGATGGAACT。

一种快速鉴别PRRSV疫苗株GDr180株与其他毒株的PCR-HRM检测方法的探针，其核苷酸序列如下所示：

Probe 1:AATGTGTCAGGCACTGTGGCTGTGTG。