[发明专利]一种快速鉴别PRRSV疫苗株GDr180株与其他毒株的PCR-HRM检测方法有效
| 申请号： | 201710398923.0 | 申请日： | 2017-05-31 |
| 公开（公告）号： | CN107099621B | 公开（公告）日： | 2020-06-16 |
| 发明（设计）人： | 郭鹏举;饶丹;丛锋;黄韧;陈梅丽;练月晓 | 申请（专利权）人： | 广东省实验动物监测所 |
| 主分类号： | C12Q1/70 | 分类号： | C12Q1/70;C12Q1/6858;C12N15/11;C12R1/93 |
| 代理公司： | 广州嘉权专利商标事务所有限公司 44205 | 代理人： | 胡辉 |
| 地址： | 510000 广*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 快速 鉴别 prrsv 疫苗 gdr180 其他 pcr hrm 检测 方法 | ||
1.一种快速鉴别PRRSV疫苗株GDr180株与其他毒株的PCR-HRM检测方法的引物和探针，其核苷酸序列如下所示：
P1:TTCTTCTTGCCTTTTCTATGCTTC；
P2:CAACTGTGTCAAGGAAATGGCT；
P3:CAGGATAGGGCATGACCGAT；
P4:CCAAATATCTCGGGATGGAACT；
Probe1:AATGTGTCAGGCACTGTGGCTGTGTG；
所述探针的一端利用修饰物进行修饰和封闭，修饰物包括氨基修饰的C6、反向dT、C3间臂。
2.一种快速鉴别PRRSV疫苗株GDr180与其他株的PCR-HRM检测试剂，该试剂含有权利要求1所述的引物和探针。
3.一种快速鉴别PRRSV疫苗株GDr180与其他株的PCR-HRM检测方法，包括下列步骤：
从待测样品中提取病毒RNA，将RNA反转录成cDNA；以cDNA为模板，用权利要求1所述的引物对P1和P2进行PCR预扩增反应，获得预扩增产物；
以预扩增产物作为模板，用权利要求1所述的引物对P3、P4以及探针Probe 1，在加入荧光饱和染料的条件下，进行不对称PCR-HRM扩增反应获得扩增产物；
对扩增产物进行HRM分析，确定待测样品为GDr180疫苗株或其他株；
所述方法不用于疾病的诊断与治疗。
4.根据权利要求3所述的PCR-HRM检测方法，其特征在于：PCR预扩增反应体系为：
5.根据权利要求3所述的PCR-HRM检测方法，其特征在于：PCR预扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸35s；循环35次；72℃终延伸5min。
6.根据权利要求3所述的PCR-HRM检测方法，其特征在于：PCR-HRM扩增反应体系为：
7.根据权利要求3所述的PCR-HRM检测方法，其特征在于：PCR-HRM扩增反应程序为：98℃变性10sec，55℃退火30sec，72℃延伸20sec，45个循环；
HRM升温步骤为92℃1min，40℃2min；50℃至90℃，升温速率为0.5℃/步。
8.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于：所述HRM分析方法如下所述：
以GDr180疫苗株不同批次的PCR产物熔解曲线探针峰Tm值为参考，若探针峰Tm值在72.64±1.17℃，主峰Tm值在84.7±0.87℃，则判定为疫苗株GDr180；
若探针峰不在此范围或无探针峰的PRRSV株，则判定为PRRSV其他毒株。
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