[发明专利]一种基于口蹄疫病毒3B表位蛋白的化学发光检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于免疫学检测领域，具体涉及一种基于口蹄疫病毒3B表位蛋白的化学发光检测试剂盒。

背景技术

口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的危害偶蹄动物的一种急性、烈性、高度接触性传染病。目前，我国对于口蹄疫的防控主要实行普遍的疫苗免疫、血清学监测和扑杀政策。因此，从口蹄疫疫苗免疫过的动物中区分出感染的动物至关重要。对于口蹄疫的诊断来说一直存在一个挑战，存在于灭活疫苗中的非结构蛋白污染而造成的假阳性问题很难解决。这是由于口蹄疫的灭活疫苗是当前使用最为普遍的口蹄疫疫苗。在灭活疫苗的纯化过程中，非结构蛋白不会完全被除去。当动物被多次免疫口蹄疫灭活疫苗后，其机体内会出现不同程度的非结构蛋白抗体，从而给区分疫苗免疫动物与病毒感染动物带来了一定的困难。

申请号为201611052512.8的中国专利申请公开了“一种牛口蹄疫3ABC抗体发光检测试剂盒”，其公开的技术方案中化学发光免疫分析板上包被的是3ABC融合蛋白，但是因为在灭活疫苗中必然会存在3ABC的相关成分，因此在多次免疫灭活疫苗后，健康动物的血清中就会出现一定程度的3ABC抗体，从而引起检测的假阳性。申请号为201611051539.5的中国专利申请公开了“一种猪口蹄疫3ABC和2C抗体化学发光检测试剂盒”，其公开的技术方案中化学发光反应板上混合包被3ABC和2C蛋白，虽然能够区分疫苗免疫的猪与口蹄疫感染的猪，但检出率并不高，只有36.03%，而且不能避免会有假阳性。当前也存在利用非结构蛋白3B单克隆抗体检测口蹄疫病毒的情况，但大多采用全蛋白，除制备过程复杂耗费人力物力外，特异性并不高，检测结果假阳性较多，而且制备的检测试剂盒检测时间较长，一般都需要1-2h，无形中增加了时间成本。因此仍需开发新的检测抗原或检测方法来解决该问题。

发明内容

面对上述难题，本发明的目的在于提供一种可区分口蹄疫病毒感染和免疫动物的化学发光免疫分析试剂盒，该试剂盒中的化学发光反应板混合包被3B非结构蛋白区域的两种表位蛋白3Bepi1和3Bepi2，首次建立了基于口蹄疫非结构表位蛋白的CLIA方法，该试剂盒能够较为准确地区分出口蹄疫病毒感染和疫苗免疫动物，尤其在免疫过5次灭活疫苗的动物检测中，准确率高达97.14%，且检测用时较短，在15分钟内即可完成检测。

一种基于口蹄疫病毒3B表位蛋白的化学发光检测试剂盒，包括化学发光反应板、酶标抗体、血清稀释液、化学发光底物和化学发光增强剂，其特征在于：所述化学发光反应板混合包被口蹄疫病毒3B非结构蛋白区域中的3Bepi1和3Bepi2两种表位蛋白。

进一步地，所述3Bepi1和3Bepi2两种表位蛋白均经基因获取、表达载体的构建、蛋白的表达和纯化制备而成，其中，在基因获取过程中，首先设计引物，然后各组引物直接退火形成分别编码3Bepi1和3Bepi2表位蛋白的双链DNA分子。

更进一步地，所述引物的组成包括各表位序列和pre-nick限制性酶切位点；其中，编码3Bepi1的双链DNA的引物序列如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示，编码3Bepi2的双链DNA的引物序列如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示。

进一步地，所述3Bepi1和3Bepi2两种表位蛋白在化学发光反应板上的包被条件均为25ng/孔。

更进一步地，化学发光反应板的包被过程为：用碳酸盐缓冲液稀释含有3Bepi1和3Bepi2表位蛋白的混合液，使混合液中3Bepi1和3Bepi2的浓度均为250ng/mL；将混合液以100µL/孔加入到化学发光反应板上，于4℃过夜进行包被；然后以300µL/孔加入封闭液，于37℃作用2h即完成包被。

进一步地，所述酶标抗体为HRP标记的兔抗牛IgG抗体；所述血清稀释液为PBS缓冲液，其中包含体积分数为0.1%的吐温和体积分数为1%的大肠杆菌裂解液；所述化学发光底物为0.1mmol/L 的鲁米诺溶液；所述化学发光增强剂包含0.07 mmol/L的IPP、3mmol/L的H₂O₂和体积分数为0.002%的Tween。

本发明还提供一种利用上述化学发光检测试剂盒的检测方法，步骤为：将待检血清样品和标准阴阳性对照血清用血清稀释液稀释5-40倍，37℃作用5min，再用PBST洗涤，加入用血清稀释液稀释20000倍的HRP标记的兔抗牛IgG抗体，37℃作用5min，经PBST漂洗后，加入化学发光底物和化学发光增强剂，5min后用化学发光免疫分析检测仪器检测发光值。

本发明的有益效果：