[发明专利]固相萃取-高效液相色谱-荧光法测定人体尿液中单胺类神经递质及其代谢物的方法

说明书

固相萃取‑高效液相色谱‑荧光法测定人体尿液中单胺类神经递质及其代谢物的方法，包括如下步骤，S1、样品的预处理；S2、样品的制备，采用自制固相萃取柱进行固相萃取；S3、标准溶液的配制；S4、标准曲线的绘制：S5、测定：取用S2获得的样品上样，进行HPLC分析，保留时间定性，峰面积定量，醋酸纤维为载体，柚子皮瓤粉作为吸附剂，柚子皮瓤粉均匀分布在醋酸纤维的间隙内，柚子皮瓤粉对尿液中的单胺类神经递质及其代谢物具有优异的灵敏度和选择性，使得人体尿液中单胺类神经递质及其代谢物富集在柚子皮瓤粉上，大大提高了样品的纯净度和灵敏度，降低了检出限，提高了回收率，提高了检测的效率；成本低廉，可以降低检测成本。

技术领域

本发明涉及人体尿液中单胺类神经递质及其代谢物测定方法技术领域，特别是涉及固相萃取-高效液相色谱-荧光法测定人体尿液中单胺类神经递质及其代谢物的方法。

背景技术

神经递质是神经末梢分泌的化学物质，在化学突触传递中担当信使的作用。单胺类神经递质(MNTs)是最早发现的一类，包括多巴胺(DA)、肾上腺素(EP)、去甲肾上腺素(NE)和5-羟色胺(5-HT)及其代谢产物香草扁桃酸(VMA)、高香草酸(HVA)、5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)。MNTs在中枢神经系统、外周植物神经系统和激素介导的内分泌及外分泌活动中起着极其重要的作用。固相萃取(Solid-Phase Extraction，简称SPE)是近年发展起来一种样品预处理技术，由液固萃取和柱液相色谱技术相结合发展而来，主要用于样品的分离、纯化和浓缩，与传统的液液萃取法相比较可以提高分析物的回收率，更有效的将分析物与干扰组分分离，正成为复杂样品的净化、富集的有效手段。

人体尿液中单胺类神经递质及其代谢物含量的准确检测，对嗜铬细胞瘤等相关疾病诊断、新药研制开发、评价药物疗效等方面有重要意义。由于人体尿液基质非常复杂，且单胺类神经递质在尿液中的含量较低，因此对检测方法的灵敏度和选择性都提出较高的要求。MNTs的检测方法主要有电化学分析法、荧光法、高效液相色谱-荧光检测法、高效液相色谱-电化学检测法、毛细管电泳法、色谱-质谱联用法。电化学分析法测定生物样品的稳定性较差，且修饰电极的使用寿命有限，灵敏度不高。毛细管电泳法的重现性较差。MNTs本身质谱响应信号不强，准确测定存在困难，且色谱-质谱昂贵。

为此，申请人发表了一篇名为“固相萃取-高效液相色谱-荧光法测定人体尿液中单胺类神经递质”的文献，通过优化前处理条件和色谱分析条件，采用了Waters Oasis WCX固相萃取柱富集、净化，高效液相色谱荧光(HPLC-FLD)检测法测定了人体尿液中4种单胺类神经递质的含量，在该优化的实验条件下，4种单胺类神经递质的回收率为92.2％～104.8％，相对偏差为1.6％～3.1％，检出限为0.002～0.05μg/ml，建立的高效液相色谱荧光检测法快速、简便，能满足人体尿液中多种单胺类神经递质的含量测定。

然而，Waters Oasis WCX固相萃取柱对其代谢产物香草扁桃酸(VMA)、高香草酸(HVA)、5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)的选择性、灵敏性以及重现性效果不够理想，因此，还难以同时对单胺类神经递质及其代谢产物进行快速有效的检测，且Waters Oasis WCX固相萃取柱是消耗品，用量大，如果在医院大规模推广应用，势必需要考虑成本因素，而且，如何进一减少尿液中的干扰组分，研发出新的固相萃取柱对尿液中单胺类神经递质及其代谢产物具有更优异的选择性，提高分析物的纯净度，降低检出限，提高灵敏度，减少检测次数，提高检测结果的准确性，加快检测速度，降低检测成本，是目前亟需解决的问题。

发明内容

为了克服上述缺点和不足，本发明的目的在于提供固相萃取-高效液相色谱-荧光法测定人体尿液中单胺类神经递质及其代谢物的方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

固相萃取-高效液相色谱-荧光法测定人体尿液中单胺类神经递质及其代谢物的方法，包括以下步骤：