[发明专利]固相萃取-高效液相色谱-荧光法测定人体尿液中单胺类神经递质及其代谢物的方法

权利要求书

1.固相萃取-高效液相色谱-荧光法测定人体尿液中单胺类神经递质及其代谢物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、样品的预处理：取新鲜人体尿液2ml，加200μl 1mol/L的盐酸溶液将尿液进行酸化处理，随后加入2.0ml 0.5mol/L的乙酸铵，混匀，超声5min后，以5000r/min离心10min，取上清液，经0.45μm滤膜过滤，滤液于4℃冰箱保存待用；

S2、样品的制备：将柚子皮瓤烘干粉碎过300～500目筛，得到柚子皮瓤粉，然后柚子皮瓤粉在真空条件下焙烧0.6-1h，焙烧的温度为300-550℃，获得柚子皮瓤吸附剂，把香烟过滤嘴内的醋酸纤维填充在SPE玻璃管内，然后再添加柚子皮瓤吸附剂，加上垫片，获得自制固相萃取柱；依次用5ml甲醇、5ml水活化自制固相萃取柱，取上述处理过的尿样4ml上样，流速为1ml/min，依次用2ml 20mmol/L乙酸铵-甲醇溶液、2ml甲醇淋洗杂质，最后用5ml含2％甲酸的体积比为85∶15的乙腈水溶液洗脱被分析物，流速为1ml/min，所得洗脱液氮吹至近干，用初始流动相复溶至1.0ml，超声2min后，经0.22μm滤膜过滤后，供HPLC分析；所述SPE玻璃管的体积为5ml，所述SPE玻璃管内设有第一过滤挡片和第二过滤挡片，所述第一过滤挡片和所述第二过滤挡片将所述SPE玻璃管分成第一吸附段、第二吸附段和第三吸附段，所述第一吸附段、所述第二吸附段和所述第三吸附段体积相等；所述第一吸附段和所述第三吸附段内填充有85-100mg的醋酸纤维，然后添加有120-150mg所述柚子皮瓤吸附剂；所述第二吸附段内填充有150-200mg的醋酸纤维，然后添加有250-300mg所述柚子皮瓤吸附剂；

S3、标准溶液的配制：准确称取肾上腺素、去甲肾上腺素、多巴胺、5-羟色胺、香草扁桃酸、高香草酸和5-羟吲哚乙酸标准品各20mg，分别置于10ml容量瓶中，0.01mol/L的盐酸溶液定容，充分震荡使其溶解，得浓度均为2000μg/ml的标准储备液，保存于4℃冰箱中；

S4、标准曲线的绘制：准确吸取肾上腺素、去甲肾上腺素、多巴胺、5-羟色胺、香草扁桃酸、高香草酸和5-羟吲哚乙酸7种标准储备液用0.01mol/L的盐酸溶液稀释为肾上腺素30.0μg/ml、去甲肾上腺素50.0μg/ml、多巴胺50.0μg/ml、5-羟色胺20.0μg/ml、香草扁桃酸60.0μg/ml、高香草酸65.0μg/ml和5-羟吲哚乙酸70.0μg/ml的标准应用液，分别准确吸取标准应用液0.01、0.05、0.30、1.00、2.00ml、2.50ml和2.50ml于10ml容量瓶中，初始流动相定容，用HPLC分析，绘制标准曲线；

S5、测定：取用S2获得的样品上样，进行HPLC分析，保留时间定性，峰面积定量，其中，HPLC的色谱条件如下，采用反相液相色谱柱Agilent C18色谱柱，型号为250mm×4.6mm，5μm；进样量为10μl；荧光检测激发波长280nm，发射波长340nm；柱温为30℃；流动相为甲醇与缓冲液的混合溶液；所述缓冲液为含0.1mmol/L乙二胺四乙酸二钠的0.04mol/L乙酸钠溶液，pH＝4；甲醇与所述缓冲液的流量为1.0mL/min；流动相的具体的梯度为，在0-6min时，甲醇与所述缓冲液的体积比为10∶90；在6-18min时，甲醇与所述缓冲液的体积比为2∶98，在18-19min时，甲醇与所述缓冲液的体积比为20∶80，在19-30min时，甲醇与所述缓冲液的体积比为2∶98，在30-40min时，甲醇与所述缓冲液的体积比为1∶98。

2.根据权利要求1所述的固相萃取-高效液相色谱-荧光法测定人体尿液中单胺类神经递质及其代谢物的方法，其特征在于，所述第二吸附段内还添加有60-80g多孔醋酸纤维素微球。

3.根据权利要求2所述的固相萃取-高效液相色谱-荧光法测定人体尿液中单胺类神经递质及其代谢物的方法，其特征在于，所述醋酸多孔醋酸纤维素微球的比表面积22m²/g，粒径为1～10微米，平均粒径6微米，平均孔径1.2微米。