[发明专利]一种植物基因组多位点编辑载体pCXUN-CAS9-RGR

说明书

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种植物基因组多位点编辑载体pCXUN‑CAS9‑RGR。本发明利用CRISPR/CAS9技术结合RGR高效转化水稻敲除相关基因得到一种载体，该载体被命名为pCXUN‑CAS9‑RGR。所述的载体包含有如序列表SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列。本发明利用RGR方法突变水稻靶基因得到高效转化载体，是一种一元载体，本发明的编辑载体可用于定向多靶位点突变水稻靶基因，研究水稻中相关基因的功能和作用，也可以用于构建相应的基因突变体和大片段缺失。本发明的载体具有很高的转化效率和打靶突变效率，可以在水稻中稳定遗传及应用。

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种新型的多位点同时定向编辑植物基因组的载体及其制备 方法和应用。本发明的载体可以对水稻的基因组进行多个位点的同时定向编辑，也可以用于构建相应的基 因突变体和大片段缺失，研究水稻中相关基因的功能和作用。

背景技术

近十年来，植物基因编辑领域的发展突飞猛进，主要依赖于几类核酸酶功能的解析。其中包括锌指核 酸酶(zinc finger nucleases,ZFNs)、转录激活子样效应因子核酸酶(transcription activator like effector nucleases,TALENs)、规律性重复短回文序列簇相关的核酸酶(clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated protein 9,CRISPR/CAS9)。这几类核酸酶均通过特异性的识别靶DNA序列，之后他们会使靶位点引入双链断裂缺口(double strand break,DSB)来启动细胞內源的两种修复机制： 非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)或者同源重组(homologous recombination,HR)。其 中NHEJ主要造成DNA缺口处的碱基插入或者缺失，HR则可以通过外源DNA模板来精确的修复DNA 或特异的添加一段DNA。但是ZFNs和TALENs两种基因编辑系统元件组装比较复杂且成本较高，而 CRISPR/CAS9系统只需要改变一小段RNA序列即可达到识别不同靶位点的能力，非常经济方便。此外 CRISPR/CAS9系统因其操作的便捷性使得该系统可以同时剪切基因组上多个不同的靶位点，这是ZFNs和 TALENs很难达到的。因此，CRISPR/CAS9系统已经广泛应用于细菌、酵母、线虫、果蝇、斑马鱼、哺乳 动物、拟南芥和水稻等生物体内。此外通过对CAS9蛋白修饰，该系统还能用于转录调控和表观修饰，使 得该系统在生物研究领域有着更广泛的前景。但是目前CRISPR/CAS9系统在多位点DNA编辑方面并不是 非常的方便，同时该系统中gRNA的表达仅能使用少量小RNA启动子。因此开发多位点DNA编辑的 CRISPR/CAS9系统以及拓宽gRNA的启动子将使得基因编辑的应用面更加广。本发明为了解决这个问题， 采用了一种全新的策略来构建多位点同时定向编辑植物基因组的载体。

发明内容