[发明专利]一种植物基因组多位点编辑载体pCXUN-CAS9-RGR

权利要求书

1.一种植物基因组多位点编辑载体pCXUN-CAS9-RGR，其特征包括，该载体通过下列步骤制备获得：

(1)以SEQ ID NO：1所示的序列的起始载体pCXUN为材料，用Xcm1切除该载体中的登陆号为NC_007635.1的ccd基因；

(2)在步骤(1)Xcm1切除了载体ccd基因的位置，即744-438碱基位上定向插入SEQ IDNO：4所示的CAS9基因片段，得到如SEQ ID NO：4所示的中间载体pCXUN-CAS9；

(3)将步骤(2)中所得到的中间载体pCXUN-CAS9，用KpnISacI消化成线性DNA，引入两个RGR，所述的RGR的引入为下列方式:

1)首先选择靶基因特异性序列gRNA，用NEB Cutter软件在http://nc2.neb.com/NEBcutter2/网站界面上输入目的基因序列，或者从相关网站上筛选找到23nt的靶序列：

N¹N²N³N⁴N⁵N⁶N⁷N⁸N⁹N¹⁰N¹¹N¹²N¹³N¹⁴N¹⁵N¹⁶N¹⁷N¹⁸N¹⁹N²⁰NGG，其中N代表任意碱基；

2)通过PCR将以下片段中的Hammerhead Ribozyme即锤头核酶序列置于gRNA的5’端，将D型肝炎病毒核酶序列置于gRNA的3’端，得到人工合成的RGR序列单元，具体序列如下所示：

最后以该人工合成的RGR序列单元为模板得到携带靶基因的RGR-基因，将靶位点的两个RGR通过重叠PCR串联在一起形成RGR-基因1+RGR-基因2；

在上述引入片段中：

波浪线的碱基部分为靶基因序列前六个碱基的互补配对序列，人工合成的RGR序列单元的位置为1-6bp；

斜体碱基部分为Hammerhead Ribozyme即锤头核酶序列，人工合成的RGR序列单元的位置为7-42bp；

方框碱基部分为D型肝炎病毒的核酶序列，人工合成的RGR序列单元的位置为176-243bp；

下划线的碱基部分是设计的基因靶位点序列，人工合成的RGR序列单元的位置为43-62bp；

GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTT是gRNA核心序列，人工合成的RGR序列单元的位置为63-175bp；

M⁶M⁵M⁴M³M²M¹与N¹N²N³N⁴N⁵N⁶补配对；

3)选择Rice U6或U3或其他不同类型启动子通过重叠PCR引入在RGR序列单元的5’端，得到启动子-RGR-基因1-RGR-基因2片段；所述的U6启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述的U3启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；

4)用Gibson一步快速连接法将U6或U3-RGR-基因1-RGR-基因2连接到线性化载体pCXUN-CAS9中，得到转化载体pCXUN-Cas9-RGR，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：6所示。

2.权利要求1所述的一种植物基因组多位点编辑载体pCXUN-Cas9-RGR在水稻转化中的应用。