[发明专利]一种提高基因低频突变检测灵敏度的扩增子文库构建方法

权利要求书

1.一种用于扩增子文库扩增和富集时使用的多重上游发卡结构引物，所述引物从3’端至5’端包括序列A1-A7：

A1序列为特异性序列，与目标区域序列互补配对，引发扩增子的特异性扩增和富集；

A2序列为发卡结构的稳定序列，由两个以上连续的C和G碱基构成；

A3序列为5’端A7序列的反向互补序列；

A4序列为发卡结构的去稳定序列，碱基个数为2-8个，碱基序列中A和T多于G和C；

A5序列为条码序列，由8-16个简并碱基构成；

A6序列为测序接头序列；

A7序列为5’端序列，与A3序列反向互补；

A3和A7互补配对，形成所述多重上游发卡结构引物的茎结构；

A4、A5和A6形成所述多重上游发卡结构引物的环部分。

2.权利要求1的多重上游发卡结构引物，所述A2序列由C和G碱基构成，碱基个数优选20个以下，更优选10个以下，最优选5个以下。

3.权利要求1或2的多重上游发卡结构引物，A3序列与A7序列形成局部双链的5’端为单链，或者A2和A3序列与A7序列形成局部双链的5’端为封闭的双链，所述双链为所述多重上游发卡结构引物的茎部分。

4.权利要求1-3任一项的多重上游发卡结构引物，所述茎结构的稳定温度是62℃-66℃，例如59-64℃，优选63℃-65℃；所述茎结构的解链稳定是70℃-78℃，例如70-76℃，优选71℃-74℃。

5.权利要求1-4任一项的多重上游发卡结构引物，所述A4序列的碱基个数为2-4个。

6.权利要求1-5任一项的多重上游发卡结构引物，所述A5序列由12个碱基序列构成，但是碱基的个数可以根据扩增子的通量进行增减。

7.权利要求1-6任一项的多重上游发卡结构引物，所述A6序列是Illumina测序接头P5序列的全长序列或去除部分5’序列的Illumina测序接头P5序列。

8.一种使用权利要求1-7任一项的多重上游发卡结构引物提高基因低频突变检测灵敏度的扩增子文库构建方法，所述方法包括以下步骤：

S1：采用多重上游发卡结构引物和带通用序列的多重下游引物进行第1轮多重PCR反应，得到扩增子，同时将A5条码序列和A6序列引入到扩增子序列的5’端；将下一轮PCR中P7接头引物识别的互补序列引入到扩增子序列的3’端；

S2：向上一轮反应体系中加入蛋白酶灭活第1轮多重PCR反应的DNA聚合酶，然后将所述蛋白酶灭活；

S3：进行第2轮接头序列PCR反应，以第1轮扩增产物为模板，以Illumuna P5接头序列为上游引物，P7接头序列为下游引物，将P5和P7序列分别引入到扩增子的两侧，得到扩增子文库；

S4：采用磁珠对S3步骤的文库进行纯化，定量后进行二代测序。

9.权利要求10的方法，在所述方法的步骤S1中，PCR反应体系中所用的上游引物为权利要求1-7任一项的多重上游发卡结构引物，下游引物序列分为两个部分，其3’端序列为特异性序列，能够与目标区域序列互补配对；其5’端序列为通用序列，能够被第2轮PCR反应中的P7引物互补配对。

10.权利要求8或9的方法，在步骤S2中，所述蛋白酶为蛋白酶K。