[发明专利]肿瘤靶向的新型钌多吡啶配合物载siRNA的制备与评价

说明书

技术领域

本发明涉及4’-甲基-(2，2’-联吡啶)-4-酰基-RGDS二氯化钌(Ru-CO-RGDS)的制备及Ru-CO-RGDS/VEGF-siRNA基因递送系统的构建，并且对其进行了体内外抗肿瘤活性和基因沉默效率的评价。本专利主要是通过RGDS修饰，增强钌吡啶配合物Ru-COOH的靶向性，使在靶部位的浓度增加，从而减小副作用，提高了治疗指数。

背景技术

基因治疗以改变人的遗传物质为基础，将外源正常基因导入靶细胞，以纠正基因缺陷或沉默相关基因表达，从而起到抗肿瘤的目的。血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)能促进血管内皮细胞增殖、迁移和肿瘤的新血管生成淋巴管的形成，增加血管通透，促进肿瘤生长、转移。在基因治疗领域中，具有的基因沉默靶向性的RNA干扰(RNA interfence,RNAi)治疗重大疾病方面显示出非常大的应用潜力。

RNA干扰是指通过双链RNA(dsRNA)在逆转录后引起该序列的同源mRNA产生特异性降解，从而达到基因沉默的作用。RNAi具有高特异性、高效性、高稳定性。VEGF存在于卵巢癌、宫颈癌等实体瘤，血液系统肿瘤等大多数重要的人类肿瘤中，且VEGF受体过高表达。因此，在根本上从基因水平抑制VEGF表达，实现抗新生血管的生成，从而达到抑制肿瘤的生长和迁移的目的。VEGF-siRNA转染被认为是一种潜在的抗肿瘤策略。

钌多吡啶金属配合物应用广泛。与核酸通过嵌入，沟槽结合和静电模式等模式结合，可作为核酸结构探针、核酸分子光开关、化学核酸酶、基因载体，因低毒性、易吸收及代谢快等并被认为成为新的最有前景的抗癌药物之一。钌多吡啶配合物作为非病毒类载体与阳离子聚合物等相比，具有更好的水溶性、更丰富的结构多样性和更合理的正电荷密度，而且更易制备，因此其作为基因领域中安全的高效的非病毒型基因载体。

精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp-X,RGDX)RGD肽可作为整合素和其配体相互作用的识别位点,介导细胞与细胞外基质蛋白及细胞间的粘附作用，同时具有信号传导功能。RGDS与整合素的特异结合,可以将治疗效应分子靶向性地导入肿瘤部位,有效地减少了对正常细胞的损害。此外，含RGDX的多肽或化合物被应用于新型材料的修饰与合成。其中，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸(Arg-Gly-Asp-Ser,RGDS)中的丝氨酸的修饰，增加了化合物的亲水性，所以在抗肿瘤药物的修饰中RGDS靶向肽具有广泛应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有抗肿瘤活性的基因递送系统，由抗肿瘤基因治疗药物VEGF-siRNA和基因载体Ru-CO-RGDS制备而成。

本发明所述的基因递送系统，其特征在于，Ru-CO-RGDS和VEGF-siRNA的重量比为1.66：1。

本发明所述的基因递送系统，为纳米结构。

本发明的另一个目的在于提供基因递送系统的制备方法，包括以下步骤：基因载体Ru-CO-RGDS与抗肿瘤基因治疗药物VEGF-siRNA在常温下以质量比为1.66:1混合，即得Ru-CO-RGDS/VEGF-siRNA。

其中，Ru-CO-RGDS的制备方法如下：4’-甲基-(2，2’-联吡啶)-4-甲酸与HCl·Arg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl液相接肽法，用三氟乙酸/三氟甲磺酸脱去保护基，形成4’-甲基-(2，2’-联吡啶)-4-酰基-RGDS，最后与钌吡啶配合物回流反应即得Ru-CO-RGDS。

其中，Ru-CO-RGDS的制备方法如下：通过液相接肽法，将4’-甲基-(2，2’-联吡啶)-4-甲酸与HCl·Arg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl在THF/DMF中通过DDC/HOBt反应，得到4’-甲基-(2，2’-联吡啶)-4-酰基-R(Tos)-G-D(OBzl)-S-OBzl；然后用三氟乙酸/三氟甲磺酸脱去保护基，形成4’-甲基-(2，2’-联吡啶)-4-酰基-RGDS；将顺-2,2'联吡啶二氯化钌与4’-甲基-(2，2’-联吡啶)-4-酰基-RGDS在N2环境下避光回流反应，回流反应结束后，旋干溶液，加入纯净水溶解后，加入饱和六氟磷酸盐溶液，出现红橙色沉淀，离心，取上清液，旋干，甲醇乙醚体系重结晶，得到Ru-CO-RGDS。