[发明专利]一种增强基因表达的自激活Gal4/UAS系统表达盒的建立

说明书

本发明公开了增强基因表达的自激活Gal4/UAS系统表达盒的建立，通过优化UAS数目及GAL4激活/结合域类型，找到一种增强效果较好的表达盒，由自身强启动子CMV启动，借助Gal4/UAS系统使转录和翻译效率提高，从而产生自动激活、级联放大的效果；在转染后第5‑10天维持较高的增强效果，第8天表达活性最高，说明表达盒增强基因表达的稳定性；在专门生产重组蛋白的CHO细胞中，增强效果大概是9倍。与现有基因表达盒相比，结构简单、增强效果显著，为基因治疗的非病毒转染途径和重组蛋白生产中增强目的基因表达提供了一种途径和新方法。

技术领域

本发明涉及一种增强基因表达的自激活Gal4/UAS系统表达盒的建立，属于生物技术领域。

背景技术

Gal4/UAS系统最早是在酿酒酵母中发现的(Oshima Y et al.1984)，它由两部分组成：编码酵母转录激活蛋白GAL4(Transcription Factor GAL4)的基因和上游激活序列(Upstream Activation Sequence,UAS，Giniger E and Ptashne 1987；Giniger Edwardet al.1985)。酿酒酵母GAL4蛋白由881个氨基酸残基构成，主要包含DNA结合域与DNA激活域两部分(Laughon et al.1984；Oshima Yasuji 1982)。DNA结合域位于蛋白N端的1～65肽段，该结构域内的7-Cys-X2-Cys-X6-Cys-X6-Cys-X2-Cys-X6-Cys40肽段构成一个Zn2Cys6结构，是结合DNA的位点(Hellauer et al.1996；Liang et al.1996)。DNA激活域位于C末端，两个结构域能够独立表达，即分别称为结合蛋白(Binding protein)和激活蛋白(Activating protein)。研究发现DNA结合域在结合DNA前后结构发生了明显的变化，使DNA结合域和特定序列结合的更加稳定。

GAL4的结合域能与特定DNA序列结合，激活下游基因的表达。GAL4结合蛋白的结合位点即上游激活序列位于Gal基因上游的100～300bp处(Guarente Leonard 1984)，Bram等通过DNA印迹法检测发现，不同的基因位点，GAL4的结合位点数不同，大约有1～4个上游结合位点，但位点都是大约30bp的保守DNA序列(Bram et al.1986)。

GAL4是真核细胞中广泛存在的进化相对保守的转录激活因子，它是一个模块化的蛋白，从广义上来讲由DNA结合域(DNA binding domain，BD)和DNA激活域(DNA activatingdomain，AD)两部分组成，结合的UAS区序列一般为CGG-N₁₁-CCG(Bram and Kornberg 1985；Elliott D.A.and Brand A.H.2008)。大量研究表明GAL4能够作为一种转录激活因子在各种生物体比如果蝇和人类细胞中存在，这也突出了它在进化过程的不同物种中对于基因表达机理的保守性。

1993年，Brand和Perrimons首次利用Gal4/UAS系统在果蝇中表达目标基因。在这一体系中，目标基因的表达是被USA调控的，而且只有当GAL4蛋白结合到UAS后，目标基因才可以被转录，因此这是一种典型的双元表达系统(Luan et al.2006)。到目前为止，该系统已经被应用于除果蝇属(Phelps and Brand 1998)以外的其他生物体，诸如非洲爪蟾(Hartley et al.2002)、斑马鱼(Asakawa and Kawakami 2008)、小鼠(Elliott D.A.andBrand A.H.2008)等。

目前，尚未见到利用基于Gal4/UAS的表达系统在人源化细胞中进行目的基因表达的报道，而且现有表达系统还存在目的基因表达量较低、表达时间短，增强表达的稳定性差等不足，因而不利于其在基因治疗的非病毒转染途径以及DNA疫苗等的发展和应用。

发明内容