[发明专利]一种饲养层细胞、培养方法及应用

说明书

本发明提供了一种饲养层细胞的培养方法，包括步骤：1)鸡骨髓间充质干细胞的获取；2)饲养层的制备。本发明打破了传统的以成纤维细胞作为饲养层的传统方法，避免了多次制备不同代次的成纤维细胞造成的不确定性与不稳定性；避免了异源细胞作为饲养层后产生的不利影响；所使用的细胞仍保持在早期胚胎期其扩增能力强和生存周期长；简化了实验操作步骤，节省了时间，降低实验成本。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及一种饲养层细胞、培养方法及应用。

背景技术

原始生殖细胞(Primordial Germ Cells，PGCs)具备发育全能性,因数量较多,可作为组织工程的新来源。它也是研究基因组印迹与胚胎早期发育关系的最佳材料,还是研究生殖细胞发育分化的体外模型、生产治疗用重组蛋白的理想来源和研究转基因动物遗传操作的有效载体。鸡胚原始生殖细胞(Chicken Primordial Germ Cells，cPGCs)应用研究广泛,相比较桑椹胚和囊胚体外培养获取干细胞优势明显；为基础研究提供了最原始的发育生物学模型；生产克隆动物,降低禽类的保种成本；生产药物蛋白,是生产治疗用重组蛋白极为理想的来源。目前cPGC无饲养层细胞的培养体系尚不完善，饲养层仍然是cPGC体外培养和大量扩增必不可少的因素，因此寻找能有效维持鸡原始生殖细胞未分化生长状态的饲养层细胞成为一个重要课题。

在cPGCs的体外培养中所采用的饲养层主要有STO细胞株、鸡胚胎原代成纤维细胞(PCEF)、性腺基质细胞(SCs)、小鼠胚胎原代成纤维细胞(PMEF)等。成纤维细胞在体外培养条件下存活时间较为有限，一般传至5、6代时便开始衰老，这就决定了必须频繁的进行成纤维细胞的制备，而不同批次制备的饲养层细胞增加了cPGCs培养过程中的不确定性和不稳定性，不利于维持cPGCs的未分化状态。以鼠源细胞作为饲养层时，异源性成分存在未知病原体感染的风险。

发明内容

为了克服现有的饲养层细胞不确定性及不稳定性高，或可能存在未知病原体感染风险的问题，可使用与cPGCs相同来源的鸡骨髓间充质干细胞(Chicken Bone Marrow-Mesenchymal Stem Cells，cBM-MSC)作为cPGCs的饲养层细胞。因为间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSC)通过对Ⅱ型组织相容性复合基因MHC-II和其他共刺激分子的低表达，以主要组织相容性复合体(Major Histocompatibility Complex，MHC)身份在供体和受体之间抑制T细胞的活动。通过这种机制，免疫排斥问题在使用同种异体MSC时显得并不特别重要。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种饲养层细胞的培养方法，包括以下步骤：

1)鸡骨髓间充质干细胞的获取：取1至10天龄的鸡的股骨和胫骨，以KO-DMEM培养基冲洗出骨内的骨髓细胞，过筛网制成单细胞悬液，将单细胞悬液放入离心管进行离心，随后弃去上层脂肪等杂质后添加cBM-MSC完全培养基进行培养；

2)饲养层的制备：将鸡骨髓间充质干细胞用含有0.02％EDTA的0.25％浓度的胰蛋白酶进行消化，调整细胞密度为5×10⁵个/mL，注入24孔板制成饲养层，待长成80％-90％汇合时，用丝裂霉素-C消化处理后进行离心，离心后再次调整细胞密度为5×10⁵个/mL，随后接种于培养板中，置于培养箱中以37℃，5％CO₂的环境条件培养至少24h。

其中，所述cBM-MSC培养基成分包括：KO-DMEM，胎牛血清，谷氨酰胺，谷丙氨酸二肽，表皮生长因子bFGF和双抗溶液。