[发明专利]一种饲养层细胞、培养方法及应用

权利要求书

1.一种鸡胚原始生殖细胞的体外培养方法，其特征在于，包括步骤：

从鸡的14-16 HH阶段胚胎的脉管系统中分离包含鸡胚原始生殖细胞的血液组织，并加入含有饲养层细胞的培养皿中，添加cPGCs完全培养基进行培养；

所述饲养层细胞的制备方法包括：取1至10天龄的鸡的股骨和胫骨，以KO-DMEM培养基冲洗出骨内的骨髓细胞，过筛网制成单细胞悬液，将单细胞悬液放入离心管，以1000rpm/min离心5min，弃去上层杂质后，收集底部细胞，添加cBM-MSC完全培养基进行培养，获取鸡骨髓间充质干细胞；

所述cBM-MSC完全培养基的成分包括：KO-DMEM，胎牛血清，谷氨酰胺，谷丙氨酸二肽，表皮生长因子bFGF和双抗溶液；将鸡骨髓间充质干细胞用含有0.02％EDTA的0.25％浓度的胰蛋白酶进行消化，调整细胞密度为5×10⁵个/mL，注入24孔板，待长成80％-90％汇合时，用丝裂霉素-C消化处理后进行离心，离心后再次调整细胞密度为5×10⁵个/mL，随后接种于培养皿中，置于培养箱中以37℃，5％CO₂的环境条件培养至少24h，制成饲养层细胞；

所述cPGCs完全培养基的成分包括：7.5％胎牛血清、2.5%鸡血清、2mM GlutaMAX-I，1×的核苷，1×的非必需氨基酸，100×的β-巯基乙醇，以及5ng/ml人LIF、5ng/ml人SCF和10ng/ml人bFGF，余量由KO-DMEM培养基补全。