[发明专利]一种围产期脐带源间充质干细胞主细胞库的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及细胞库的制备方法，具体来说，涉及一种围产期脐带源间充质干细胞主细胞库的制备方法。

背景技术

间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）是一类具有自我更新和多向分化潜能的成体干细胞，是最重要的工程种子细胞之一，可以体外大规模培养而不丧失自我更新和多向分化潜能，在药物研发、再生医学和组织工程、基因工程等领域有广阔的应用前景。

2012年，Osiris公司研发的用于治疗儿童急性移植物抗宿主病的PROCHYMAL在加拿大、新西兰获得上市批准，成为干细胞再生医学发展史上的标志性事件。随后，Hearticellgram-AMI、Cupistem、Cartistem、 Osteocel、Trinity、LiquidGen等MSCs产品或组织工程产品获批，细胞治疗的临床应用已经进入成熟期。

近些年来发现，围产期新生儿附属物，包括胎盘、羊膜、脐带中含有丰富的MSCs，是最适于建立MSCs生物样本库的样本资源。虽然MSC的分离、培养方法不断改进，但满足细胞库存储的细胞得率仍旧不高。我们的调查发现，个体脐带MSCs存储的合同约定存储量为P2代MSCs 1X10⁸。按照静脉输入P3代细胞剂量1X10⁸/疗程，大约够10个疗程，无法满足“干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则(试行)”的内部质控和质量复核的细胞量要求，因此目前的MSCs库依旧是个体化治疗库，无法满足配型库制备主细胞库、工作细胞库的细胞量需求，究其原因主要是原代培养工艺落后导致原代细胞得率低造成的。

针对相关技术中的问题，目前尚未提出有效的解决方案。

发明内容

针对相关技术中的上述技术问题，本发明提出一种围产期脐带源MSCs主细胞库的制备方法，能够提高P0代MSCs得率，满足配型库的质控细胞量和移植细胞量要求。

为实现上述技术目的，本发明的技术方案是这样实现的：

一种围产期脐带源间MSCs主细胞库的制备方法，包括如下步骤：

S1.将足月剖腹产健康新生儿脐带进行无菌采集；

S2.对产妇进行病原微生物筛查，对脐带样本进行无菌检测；

S3.将脐带样本在生理盐水中洗净残血，用消毒酒精浸泡，再经生理盐水漂洗两次；

S4.用生理盐水灌注血管，挤出残血，将脐带样本剪碎成组织块，用生理盐水漂洗3次；

S5.将明胶用去离子水溶解，湿热灭菌,冷却，缓慢加入2XDMEM（L），水浴摇床混匀；

S6.取组织块，加入明胶溶液，转移至组织培养瓶中平铺，置于4℃冰箱中过夜后，向培养瓶中加入完全培养基，置于37℃，5% CO₂培养箱内培养，至细胞长满凝胶层时收获；

S7.收获时以胰蛋白酶消化法收获细胞，经细胞筛过滤、离心获得P0代MSCs，P0代MSCs冻存，记为脐带源MSCs主细胞库。

进一步地，所述步骤S1中新生儿脐带进行无菌采集长度为15-20cm，两端结扎，所述步骤S3中经生理盐水漂洗两次后，需要在结扎处剪断，弃去两端。

进一步地，所述步骤S3中使用75%的消毒酒精浸泡30秒。

进一步地，所述步骤S2中产妇经病原微生物筛查，应无HIV、HBV、HCV、HTLV、EBV、CMV、TP感染，脐带样本浸泡在生理盐水中，采集残血血样进行无菌检测，结果应为阴性，进行支原体检测，结果应为阴性。

进一步地，所述步骤S5中，所用明胶为24g，以55℃100mL去离子水溶解，116℃条件下湿热灭菌15分钟,冷却至40℃，缓慢加入预温至40℃的100mL2XDMEM（L）中，水浴摇床混匀。

进一步地，所述DMEM（L）含有4%的Ultroser G serum substitute，所述DMEM（L）中rh b-FGF的浓度为50ng/mL。

进一步地，所述步骤S6中，取2cm脐带样品的组织块，加入15ml明胶溶液，搅拌混匀，转移至组织培养瓶中平铺，置于4℃冰箱中过夜后，每个培养瓶中缓慢加入15ml完全培养基，置于37℃，5% CO₂培养箱内培养，每3天观察，每7天换液，至细胞长满凝胶层时收获。