[发明专利]一种围产期脐带源间充质干细胞主细胞库的制备方法

权利要求书

1.一种围产期脐带源间充质干细胞主细胞库的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.将足月剖腹产健康新生儿脐带进行无菌采集；

S2.对产妇进行病原微生物筛查，对脐带样本进行无菌检测；

S3.将脐带样本在生理盐水中洗净残血，用消毒酒精浸泡，再经生理盐水漂洗两次；

S4.用生理盐水灌注血管，挤出残血，将脐带样本剪碎成组织块，用生理盐水漂洗3次；

S5.将明胶用去离子水溶解，湿热灭菌,冷却，缓慢加入2XDMEM（L），水浴摇床混匀；

S6.取组织块，加入明胶溶液，转移至组织培养瓶中平铺，置于4℃冰箱中过夜后，向培养瓶中加入完全培养基，置于37℃，5% CO₂培养箱内培养，至细胞长满凝胶层时收获；

S7.收获时以胰蛋白酶消化法收获细胞，经细胞筛过滤、离心获得P0代MSCs，P0代MSCs冻存，即为脐带源MSCs主细胞库。

2.根据权利要求1所述的一种围产期脐带源间充质干细胞主细胞库的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中新生儿脐带进行无菌采集长度为15-20cm，两端结扎，所述步骤S3中经生理盐水漂洗两次后，需要在结扎处剪断，弃去两端。

3.根据权利要求1所述的一种围产期脐带源间充质干细胞主细胞库的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中使用75%的消毒酒精浸泡30秒。

4.根据权利要求1所述的一种围产期脐带源间充质干细胞主细胞库的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中产妇经病原微生物筛查，应无HIV、HBV、HCV、HTLV、EBV、CMV、TP感染，脐带样本浸泡在生理盐水中，采集残血血样进行无菌检测，结果应为阴性，进行支原体检测，结果应为阴性。

5.根据权利要求1所述的一种围产期脐带源间充质干细胞主细胞库的制备方法，其特征在于，所述步骤S5中，所用明胶为24g，以55℃100mL去离子水溶解，116℃条件下湿热灭菌15分钟，冷却至40℃，缓慢加入预温至40℃的100mL2XDMEM（L）中，水浴摇床混匀。

6.根据权利要求5所述的一种围产期脐带源间充质干细胞主细胞库的制备方法，其特征在于，所述DMEM（L）含有4%的Ultroser G serum substitute，所述DMEM（L）中rh b-FGF的浓度为50ng/mL。

7.根据权利要求1所述的一种围产期脐带源间充质干细胞主细胞库的制备方法，其特征在于，所述步骤S6中，取2cm脐带样品剪碎获得的约40块组织块，加入15ml明胶溶液，搅拌混匀，转移至组织培养瓶中平铺，置于4℃冰箱中过夜后，每个培养瓶中缓慢加入15ml完全培养基，置于37℃，5% CO₂培养箱内培养，每3天观察，每7天换液，至细胞长满凝胶层时收获。

8.根据权利要求7所述的一种围产期脐带源间充质干细胞主细胞库的制备方法，其特征在于，步骤S6中所述的完全培养基为DMEM（L），所述完全培养基含有40%的MCDB201、1%的ITS、2%的FBS，所述完全培养基中地塞米松浓度为50 nmol/L，抗坏血酸浓度为0.1 mmol/L，rh LIF浓度为10³U/mL，rh PDGF-b浓度为10ng/mL，rh EGF浓度为10ng/mL。

9.根据权利要求1所述的一种围产期脐带源间充质干细胞主细胞库的制备方法，其特征在于，所述步骤S7中，收获细胞时，小心吸弃培养上清，加入5mL含0.08%EDTA的0.25%胰蛋白酶消化液，震荡混匀，室温消化10min；加入1mL抑肽酶溶液终止消化；400g离心，5min，弃上清，收获沉淀物；以生理盐水洗涤2次，以100um尼龙细胞筛过滤，收集滤液；400g离心，5min，弃上清，收获沉淀物；记为P0代；P0代细胞冻存，即为脐带源MSCs主细胞库。