[发明专利]检测人体尿液中新蝶呤和生物蝶呤的方法

说明书

本发明公开了一种准确、快速、高通量检测人体尿液中新蝶呤和生物蝶呤的方法，包括将前处理后的尿样以液相色谱进行分析，色谱柱为反向键合硅胶柱；流动相为甲醇和乙酸铵缓冲液，梯度洗脱；之后以荧光检测器检测。本发明方法成本低，前处理简单，可实现批量处理检测，优化色谱方法缩短了分析时间，大大提高样本通量，特别适用于临床和日常检测对色谱方法的需求。

技术领域

本发明涉及一种检测方法，特别涉及一种检测人体尿液中新蝶呤和生物蝶呤的方法。

背景技术

新蝶呤和生物蝶呤是体内三磷酸鸟苷(GTP)的代谢产物，而三磷酸鸟苷(GTP)是辅酶四氢生物蝶呤(tetrahy drobiopterin，BH4)合成过程中的重要组成部分，两种蝶呤主要通过尿液排泄，专业人员通过其含量及二者的比值可以有效区分高苯丙氨酸血症的分型。因此，对HPA患儿进行早期BH4缺乏症的鉴别诊断非常重要。非典型的高苯丙氨酸血症与传统高苯丙氨酸血症有着不完全相同的治疗方案，开发建立一种适合临床医学检验的前处理方法、准确，快速，高通量的色谱方法有利于快速大批量地获得准确的数据，有助于专业人员进行相应的分析评价，具有重要意义。

尿液中含大量盐等水溶性强极性杂质，新蝶呤和生物蝶呤又极易发生水解，保存稳定性差，不适合在高有机相比例的HILIC模式下进行大量样本检测，传统方法多采用25cm的C18色谱柱增强保留和分离效果，分析时间较长，不符合临床医学检验快速、高通量的要求。同时，传统的HILIC模式，液质联用等方法的检测成本比较高，不利于推广使用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种准确、快速、高通量检测人体尿液中新蝶呤和生物蝶呤的方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种检测人体尿液中新蝶呤和生物蝶呤的方法，包括如下步骤：

1)前处理：对尿液进行液相检测前处理；

2)液相洗脱：将前处理后的尿样以液相色谱进行分析，所述分析条件为：

固定相：色谱柱为反向键合硅胶柱；

流动相：A相为甲醇；B相为15～25mmol/L的乙酸铵缓冲液，并以乙酸调pH 5.5～7.0；梯度洗脱方式；

3)检测：以荧光检测器检测。

作为上述方法的进一步改进，所述色谱柱为Poroshell 120EC-C18；

作为上述方法的进一步改进，梯度洗脱方式为：

色谱柱的柱温为28～32℃；

流动相的流速为0.3～0.5mL/min。

作为上述方法的进一步改进，液相洗脱时的进样量为0.5～2μL。

作为上述方法的进一步改进，检测条件为：激发光波长为358～362nm，发射光波长为448～452nm。

作为上述方法的进一步改进，前处理步骤之前，还包括预处理步骤，所述预处理步骤为：尿液收集后立即加入5～7M的盐酸，冷冻避光保存。

作为上述方法的进一步改进，前处理步骤包括如下步骤：

1)取样：放置解冻至室温，混匀，取样品加入离心管；

2)氧化：加入碘/碘化钾溶液，震荡后置于离心机中避光反应；

3)中和：离心，依次抗坏血酸、氢氧化钠，涡旋震荡后离心；

4)过滤：取上清液过0.22μm水相滤膜进样分析。