[发明专利]白色念珠菌场发射扫描电子显微镜样品的快速制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体为白色念珠菌场发射扫描电子显微镜样品的快速制备方法。

背景技术

白色念珠菌(Candida albicans)的生物被膜也称生物膜。在自然界中，绝大多数的细菌存在于生物被膜中。已有研究表明，部分白色念珠菌的生物被膜的存在与其致病的严重程度相关，因此探究白色念珠菌的生物膜结构也逐渐成为科研工作者们所关注的一个重点。

扫描电镜已成为一种研究微观世界的有力工具，很多重大发现和研究成果都是通过观察获得的。然而，在实际进行仪器观察操作时，由于扫描电镜是高精密仪器，结构复杂，且影响其成像的因素较多。想要获得高分辨率、立体感强、层次、细节分明，保持样品原始形貌的高质量扫描电镜图像，样品的快速制备起着至关重要的作用，同时扫描电镜的使用和参数的设置也直接影响到图像质量。表面结构由于受多种因素的影响，反差降低，此外，脱水过程、镀膜操作等样品处理的影响，图像质量下降，必须选择合适而且快速的样品制备方法与电镜观察参数才能观察到清晰的菌体外周微细结构。

白色念珠菌扫描电镜样品的传统制备方法，将念珠菌菌悬液以8000rpm离心3～5min后，弃掉上清液，获得菌体后分别进行以下操作:①将上述获得的白色念珠菌菌体加入到2.5％戊二醛固定液中于4℃冰箱固定2h；②pH为7.2的磷酸缓冲液PBS清冼2～3次；③1％锇酸处理1h；④pH为7.2的磷酸缓冲液PBS清冼2～3次；⑤乙醇梯度脱水，依次为30％，50％， 70％，85％，95％各1次(10min/次)，100％乙醇2次(20min/次)；⑥采用乙酸异戊酯置换 2次，20min/次；⑦鼓风烘干干燥：将离心浓缩后的菌液小心滴入到小滤纸袋内并及时封口，放入至55℃的鼓风干燥箱内干燥4h；⑧离子溅射喷金后，调整并设置部分参数即可进行扫描电镜来观察菌体生物膜的形态结构。

采用传统的制备方法对白色念珠菌进行了扫描电镜样品的制备如图1所示。

对病原微生物白色念珠菌采用传统的制备方法，扫描电镜观察并拍照，可以清楚的看出在固定过程中，常规方法采用2.5％戊二醛固定2h，1％锇酸固定1h由于样品固定时间相对较短而导致样品周围存在病原微生物白色念珠菌的分泌物(如图1)。

在清洗过程中，传统的方法使用pH7.2的磷酸缓冲液PBS清洗样品时，会留下的磷酸盐颗粒将部分样品覆盖遮蔽(如图2)。

传统的干燥方法处理样品后的图像，其中(如图3)是55℃烘干6h的样品；可见，常规干燥方法使样品出现微小的形变和生物膜小部分脱落。

传统的方法使用不同浓度梯度乙醇脱水，而脱水的时间不同对样品表面结构影响较大，观察结果显示，样品梯度脱水每步10min时，菌体生物膜表面龟裂、或不同程度皱缩凹陷甚至是断裂(如图4)，且损伤较大。

发明内容

针对传统制备病原微生物白色念珠菌扫描电镜样品方法中存在的问题，本发明提供一种白色念珠菌场发射扫描电子显微镜样品的快速制备方法，该方法更为实用、经济、高效。

具体的技术方案为：

将冷藏存于4℃冰箱中固体斜面上的白色念珠菌菌株挑出后，在超净工作台里接种于固体马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，划线并培养于30℃的恒温培养箱中培养12h后，挑取培养皿上单菌落至液体普通肉汤培养基里于30℃的空气浴振荡器中以200rpm培养12～24h，得到白色念珠菌菌悬液；

将白色念珠菌菌悬液以8000rpm离心3～5min后，弃掉上清液，获得白色念珠菌菌体进行以下操作：

(1)将白色念珠菌菌体加入到2.5％戊二醛固定液中于4℃冰箱单固定4h；

(2)采用无菌去离子水清冼2～3次；

(3)不同浓度梯度的叔丁醇脱水，叔丁醇质量浓度依次为30％、50％、70％、85％、 95％，各1次，5min/次，然后用100％叔丁醇脱水2次，15min/次，其中：每次脱水后均需以8000rpm、3～5min离心弃掉上清液；再转入至下一种试剂，每次用移液枪吹打3～5次，打散菌块；

(4)真空干燥：将离心浓缩后的菌液滴入到纯叔丁醇中在4℃冰箱冷冻10min后，放入至真空干燥箱内干燥；

(5)离子溅射喷金：待干燥后的样品温度升到室温后取出倒入至培养皿，轻摇分散菌体；采用碳导电胶带一面粘在盖玻片上，另一面倒扣轻压在菌体粉末上，翻正后用镊子将菌体刮薄铺平；离子溅射喷金后，调整并设置参数即可进行扫描电镜来观察菌体生物膜的形态结构。