[发明专利]基于HPLC-MS/MS检测平台的溶血磷脂酰胆碱的绝对定量分析方法

权利要求书

1.一种基于HPLC-MS/MS检测平台的溶血磷脂酰胆碱的绝对定量分析方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

（1）标本预处理：将人血清标本进行预处理去除干扰蛋白质；将人血清标本进行预处理除去干扰蛋白质的过程中加入了0.1% BHT的甲醇溶液进行前处理；

（2）色谱分离：经过步骤（1）处理的标本注入到高效液相色谱柱中完成标本的初步分离；所述色谱柱是Durashell C18（L）色谱柱；流动相是0.1%甲酸25mM甲酸铵-水溶液、0.1%甲酸-甲醇溶液；流动相的参数如下：0min时，0.1%甲酸25mM甲酸铵-水溶液的占比为70%，0.1%甲酸-甲醇溶液的占比为30%；0.5min时，0.1%甲酸25mM甲酸铵-水溶液的占比为50%，0.1%甲酸-甲醇溶液的占比为50%：50%，1min时，0.1%甲酸25mM甲酸铵-水溶液的占比为0%，0.1%甲酸-甲醇溶液的占比为100%；4min时，0.1%甲酸25mM甲酸铵-水溶液的占比为0%，0.1%甲酸-甲醇溶液的占比为100%；4.1min时，0.1%甲酸25mM甲酸铵-水溶液的占比为70%，0.1%甲酸-甲醇溶液的占比为30%；5min时，停止；

（3）质谱鉴定：初步分离后的标本进入质谱仪，完成定量分析离子碎片到的强度和质谱图的绘制，质谱仪的参数设置见下面的表格：

表格中“*”表示定量离子对；“Q1”指母离子，“Q3”指子离子，单位均为质荷比m/z；“DP1”表示去簇电压，单位是伏特；“CE2”表示碰撞电压，单位是伏特；

所述方法使用利血平作为溶血磷脂酰胆碱类物质定量检测的内标物。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）使用的质谱仪采用了Turbo VTM离子源和帘气的设计、电离模式是电喷雾电离、质量分析器是三重四级杆、所述三重四级杆采用的是多反应检测模式进行扫描检测。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）的详细工艺如下：

1）配制含有0.1%BHT的甲醇溶液：70mL甲醇溶液加入70mg BHT，充分涡旋使BHT完全溶解；

2）预处理去除干扰蛋白前的前处理：

配制标准曲线样品溶液：标准曲线样品溶液共有S1-S7个浓度水平，称取LPC 14:0、LPC15:0、LPC 16:0、LPC 17:0和LPC 18:0的标准品分别1.875mg、3.750mg、56.250mg、5.625mg和37.500mg溶解于50mL甲醇溶液中，充分混匀溶解后，取5μL移至20μL甲醇溶液中，即制成S7浓度的标准曲线样品溶液，S7溶液用甲醇稀释两倍得S6，S7浓度的溶液甲醇稀释3倍得S5，S5稀释2倍得S4，S5稀释5倍得S3，S3稀释2倍得S2，S2稀释2倍得S1；

配制标本：取100μL人血清至EP管内，加入25μL含有0.1%BHT的甲醇，充分涡旋均匀即得一份标本；

3）预处理去除干扰蛋白：先向Cleanert PPT 96孔蛋白沉淀板中加入含100ppb利血平的150μL含有0.1%BHT的甲醇溶液，再加入经过步骤2）前处理的标本25μL，使用96孔板振荡器于600rpm涡旋5min混合均匀后静置10min，最后使用Cleanert M96生物样品前处理仪将去蛋白后的溶液收集到洁净的收集板中备用；

4）将收集板里的溶液在Cleanert ® V96 样品氮吹浓缩仪中用氮气吹干，温度设定为30℃；吹干后标本再于1mL 80%甲醇水溶液中复溶，涡旋器上混合均匀后即可进行后续测试，所述甲醇水溶液中含有0.1% BHT。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中高效液相色谱柱的流速设定为800μL/min，柱温固定在30℃，进样量设定为5μL。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱柱孔径150Å，色谱柱中C18的直径大小约5μm，色谱柱大小为3.0*50mm。

6.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述溶血磷脂酰胆碱选自以下组：LPC 14:0、LPC 15:0、LPC 16:0、LPC 17:0、LPC 18:0。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述溶血磷脂酰胆碱选自以下组：LPC 14:0、LPC 15:0、LPC 16:0、LPC 17:0、LPC 18:0。