[发明专利]一种铁皮石斛原球茎液体静止悬浮培养快速增殖方法

说明书

技术领域

本发明属于生物植物组织培养、组织快繁技术领域，更具体地说，尤其涉及一种铁皮石斛原球茎液体静止悬浮培养快速增殖方法。

背景技术

铁皮石解是我国传统的名贵中药，具有很高的药用价值。主要成分为石斛多糖和石斛碱，具有滋阴、益胃、生津止渴、润肺止咳、强壮及增强免疫活性的作用，为南亚和东南亚地区著名的中草药。早在1987年就被国务院列为二级保护野生植物。其加工品“西枫斗”是价格昂贵的出口药材。由于铁皮石斛生长环境特殊，自身繁殖困难，加上人们无休止地采挖以及自然生境的不断丧失，导致野生铁皮石斛愈来愈稀少，以濒临灭绝。因此对铁皮石斛组培繁殖方法进行研究显得十分必要。利用组织培养技术，对药用铁皮石斛进行快速繁殖，是目前解决生产种苗问题的有效方法。不仅对保护濒危物种有重要意义，而且对发展药用植物产业具有重要的现实价值。

目前，对石斛组织培养技术的研究与报道很多，其方法也多种多样。组织培养获取再生植株的方式主要有以下几种：(1)种子→原球茎→小植株；(2)种子→原球茎→愈伤组织→丛芽→生根苗；(3)种子→原球茎→无菌苗茎段→小植株；(4)种子→愈伤组织→原球茎→小植株；(5)原球茎→人工种子→幼苗；(6)茎尖→愈伤组织→丛芽→生根苗等。但目前许多组培企业多采用固体培养基培养铁皮石斛原球茎，其中主要凝固成分为琼脂，市面上琼脂价格在110-130元/kg左右，导致生产成本上升；其次固体培养基接种速度慢，导致人力成本上升。且固体培养基增殖石斛原球茎，增殖量小、周期长。一直是制约石斛组培企业及整个石斛产业链发展的瓶颈。

其一，某科研团队建立了铁皮石解原球茎增殖的液体悬浮培养体系。在名为“铁皮石斛原球茎悬浮培养研究”的研究中，其技术方法为：首先在添加0.5mg/LABA的1/4MS培养基里预培养30d，然后转入1/4MS+40mg/LVc液体培养基，pH5.6，摇床转速为50r/min，每15d继代一次，黑暗培养。原球茎的质量提高、同步性好。无论鲜重还是干重，增长量都比较好。

其操作方案为：选活力强、均匀一致的鲜黄色原球茎称重，置于装有液体培养基(pH5.6)的4.5cm培养皿中，每皿接种50个原球茎，培养温度为(25±1)℃，黑暗中培养，每10d换液一次，60d后，倾去培养液，称鲜重和干重，同时统计原球茎的数量，并测量其长度。

该技术需要摇床震荡培养，导致生产设备投入增加，能耗增加。培养铁皮石斛原球茎的成本提升，且生产工艺繁琐，严重阻碍了该技术的工业化发展。

其二，某科研团队，在“铁皮石斛原胚体液体悬浮培养条件”研究中报道，以铁皮石斛种子诱导的原胚体为材料，在1/2MS+1.0mg/LNAA，pH5.6，蔗糖浓度为3％或含10％香蕉提取物上清液的液体培养基中增殖效果佳，可溶性多糖成分积累相对较高。其接种量为每20ml接种2g石斛原球茎。

其培养条件为：(温度25±1)℃，光照10h/d，光照强度为60umol*m^-2*s^-1，转速100r/min，50d继代一次。

该技术同样需要摇床震荡培养，增加了设备投入及能耗，不利于企业的长远发展，且培养基成分添加复杂，稳定性差，不可工业化生产。

但以上的设计中，都需要用到摇床震荡培养，这不仅增加了生产设备的投入，而且增加了能耗、增加了生产环节，从而使生产成本上升，阻碍了液体悬浮培养这一技术的应用及工业化发展。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种铁皮石斛原球茎液体静止悬浮培养快速增殖方法在整个石斛原球茎液体悬浮培养过程中，无需摇床震荡，完全是静止培养，使铁皮石斛原球茎液体悬浮培养技术真正能走向产业化生产。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种铁皮石斛原球茎液体静止悬浮培养快速增殖方法，包括如下步骤：

S1、选择原材料：采自云南文山广南山区的自然授粉结实、成熟、未开裂的铁皮石斛蒴果；

S2、材料消毒：对成熟未开裂蒴果进行消毒处理；

S3、接种：将消毒处理后的蒴果在无菌条件下，用镊子夹紧果柄一端，用解剖刀将蒴果另一端切一小口，轻轻抖动，将种子均匀撒布在诱导种子萌发培养基上，立即盖上瓶盖，放在培养室进行培养；

S4、铁皮石斛原球茎的选择：选择由铁皮石斛种子诱导出的生长状态良好、无分化、色泽鲜绿的原球茎为材料，在超净工作台里接种，接种原球茎直径在0.3-0.5cm，质量1-3g为宜；