[发明专利]一种铁皮石斛原球茎液体静止悬浮培养快速增殖方法

权利要求书

1.一种铁皮石斛原球茎液体静止悬浮培养快速增殖方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、选择原材料：采自云南文山广南山区的自然授粉结实、成熟、未开裂的铁皮石斛蒴果；

S2、材料消毒：对成熟未开裂蒴果进行消毒处理；

S3、接种：将消毒处理后的蒴果在无菌条件下，用镊子夹紧果柄一端，用解剖刀将蒴果另一端切一小口，轻轻抖动，将种子均匀撒布在诱导种子萌发培养基上，立即盖上瓶盖，放在培养室进行培养；

S4、铁皮石斛原球茎的选择：选择由铁皮石斛种子诱导出的生长状态良好、无分化、色泽鲜绿的原球茎为材料，在超净工作台里接种，接种原球茎直径在0.3-0.5cm，质量1-3g为宜；

S5、采用石斛原球茎液体静止悬浮培养，其培养基配方为:B5培养基+0.4-1.0g/L萘乙酸+50-100g/L土豆+20-30g/L蔗糖，pH值5.5-5.8；基本培养条件：温度22-28℃,光照12-14h/d，光照强度为3000lx-4500lx，悬浮培养过程中使用150mL的三角烧瓶或玻璃培养瓶作为培养容器。

2.根据权利要求1所述的一种铁皮石斛原球茎液体静止悬浮培养快速增殖方法，其特征在于：在S3中，诱导种子萌发培养基及培养条件：以MS基本培养基，附加琼脂0.68％，6-苄基氨基嘌呤0.4-0.6mg/L、萘乙酸0.1-0.4mg/L、土豆80-100g/L、吲哚丁酸0.2-0.5mg/L、蔗糖20-30g/L；培养基pH值5.4～5.8；培养条件：温度25～28℃，光照12h/d，光照强度2000lx。

3.根据权利要求1所述的一种铁皮石斛原球茎液体静止悬浮培养快速增殖方法，其特征在于：在S5中，具体过程如下：

(1)配制B5基础培养基母液，其中大量元素A为20倍浓缩；微量元素B为1000倍浓缩；铁盐C为100倍浓缩；有机D为1000倍浓缩；肌醇为500倍浓缩；

(2)以配制5L为列，选择5L的量筒，先加入1L的水，然后依次按比例加入0.4-1.0g/L萘乙酸、50-100g/L土豆和20-30g/L蔗糖；

(3)加入土豆汁，土豆清洗后去皮，按配方称取需要量，榨汁后过滤，去掉土豆渣及上层白沫；

(4)加完培养基成分后，加入去离子水，定容到5L，然后调PH值；

(5)按配方量装瓶，封口后放入灭菌锅，121℃高温高压湿热灭菌20-25min；

(6)取出培养基，放入干净、相对无菌的接种室，放置5-7天，待培养基无染菌现象后接种；

(7)在超净工作台里接种，培养基放入超净工作台前，用75％酒精雾喷消毒；

(8)把挑选好的铁皮石斛原球茎，用灭过菌的镊子夹碎成适当大小，转接入液体悬浮培养基中，接种量为1-3g。

(9)封口，暗处理1-3天后，放入光照培养室培养。

4.根据权利要求1所述的一种铁皮石斛原球茎液体静止悬浮培养快速增殖方法，其特征在于：在S2中，对成熟未开裂蒴果进行消毒处理方法为：成熟未开裂蒴果→自来水冲洗→75％酒精浸泡1min→0.1％升汞溶液浸泡15min→无菌水冲洗4次→无菌滤纸吸干后备用。

5.根据权利要求1所述的一种铁皮石斛原球茎液体静止悬浮培养快速增殖方法，其特征在于：在S2中，对成熟未开裂蒴果进行消毒处理方法为：成熟未开裂蒴果→75％酒精表面擦拭→75％酒精浸泡1min→无菌滤纸吸干后备用。