[发明专利]一种携带去优化M基因和两个G基因的重组狂犬病病毒

说明书

本发明公开了一种携带去优化M基因和两个G基因的重组狂犬病病毒。本发明首先将M基因阅读框部分进行去优化，优化后序列如SEQ ID NO.2所示。然后以狂犬病病毒HEP‑Flury株为骨架，将去优化后M基因替换HEP‑Flury中的M基因，再插入额外一个狂犬病毒的G基因，得到携带去优化M基因和两个G基因的重组狂犬病病毒pHEP‑dG‑M^min质粒，最后拯救筛选获得重组狂犬病病毒株rHEP‑dG‑M^min。该重组病毒具有更高的病毒滴度，可以降低犬用疫苗的成本。高感染复数时能够表达更高水平的G蛋白且病毒的复制和各结构基因的转录都增高，有作为狂犬病疫苗候选株的潜力。

技术领域

本发明属于病毒分子生物学技术领域。更具体地，涉及一种携带去优化M基因和两个G基因的重组狂犬病病毒。

背景技术

狂犬病(rabies)是由狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)引起的致死性、高度嗜神经性人兽共患烈性传染病。99％的人狂犬病感染都来自病犬，狂犬病通过感染家畜和野生动物经咬伤或抓伤(通常经由唾液)传播至人。全球每年约有60,000的人死于狂犬病，亚洲和非洲占95％以上，我国狂犬病发病人数仅次于印度，高居世界第二位。目前尚无有效的治疗方案，免疫预防是防控该病的主要措施。因此，探究狂犬病病毒的复制与致病机理、研发廉价高效的疫苗尤为重要。

2015年12月，世卫组织等提出到2030年为止根除人类狂犬病。在我国，狂犬病病毒的主要带毒和传播宿主是犬，要想在我国根除人狂犬病，必须普及家养犬只的免疫，在动物间建立免疫壁垒，消灭动物狂犬病。我国目前的兽用灭活狂犬疫苗，因生产规模的限制、生产成本的偏高，国产兽用灭活疫苗尚未在国内大量施用。绝大部分经济发达的城市仍然首选进口灭活疫苗，这些灭活疫苗对于农村和经济落后地区来说价格太高，难以大规模推广使用，国产的灭活疫苗虽然价格便宜，但其免疫效果不佳。因此，有必要进一步降低研发成本，开发出价格低廉、安全、有效的人用及兽用狂犬病疫苗。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有狂犬病疫苗的缺陷和不足，利用分子生物学手段，以狂犬病疫苗候选株HEP-Flury为骨架，将去优化的M基因以及额外一个狂犬病毒的G基因插入HEP-Flury；通过拯救获得携带去优化M基因且具有两个G的重组狂犬病毒株，其病毒的滴度显著升高，高感染复数时，G蛋白的表达量升高、病毒各基因的转录增强。

本发明目的是提供一种携带去优化M基因和两个G基因的重组狂犬病病毒。

本发明另一目的是提供所述重组狂犬病病毒的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明首先将M基因阅读框部分进行去优化，然后将去优化的M基因替换至HEP-Flury及G基因同时克隆至HEP-Flury的G和L假基因区，并拯救出重组病毒。并进一步对重组病毒的复制、转录及结构蛋白表达进行探究为临床应用提供理论依据。结果成功构建了一种携带去优化M基因和两个G基因的重组狂犬病病毒rHEP-dG-M^min，该重组病毒rHEP-dG-M^min携带两个G基因且M基因去优化，与亲本rHEP-dG相比，病毒的滴度更高，高感染复数时能够表达更高水平的G蛋白且病毒的复制和各结构基因的转录都增高。M基因去优化后对病毒的复制、转录及蛋白表达产生一定的影响，更清楚地阐明M蛋白的调节功能。

因此，以下内容均应在本发明的保护范围之内：

去优化后M基因，其阅读框去优化的结果如表1所示，序列如SEQ ID NO.2所示。

该基因的去优化是基于鼠源密码子库，利用其在翻译蛋白质时使用密码子的频率，将氨基酸的密码子去优化为使用频率较低的同义密码子，通过细胞内可用的tRNAs量的差异对翻译过程产生影响。增加病毒M基因CpG和UpA二核苷酸的数量，对其翻译过程产生负面影响。