[发明专利]一种携带去优化M基因和两个G基因的重组狂犬病病毒

权利要求书

1.一株携带去优化M基因和两个G基因的重组狂犬病病毒rHEP-dG-M^min，其特征在于，是以狂犬病病毒HEP-Flury株为骨架，将序列如SEQ ID NO.2所示的去优化后M基因替换HEP-Flury中的M基因，再插入额外一个狂犬病病毒的G基因，得到携带去优化M基因和两个G基因的重组狂犬病病毒pHEP-dG-M^min质粒，最后拯救筛选获得重组狂犬病病毒株rHEP-dG-M^min；其中，构建后的两个G基因相邻。

2.根据权利要求1所述的重组狂犬病病毒rHEP-dG-M^min，其特征在于，其构建方法包括如下步骤：

S1.构建重组质粒pHEP-3.0-M^min：将序列如SEQ ID NO.2所示的去优化后M基因无缝克隆替换狂犬病病毒HEP-Flury株全长cDNA中的M基因；

S2.构建重组质粒pHEP-dG-M^min：在重组质粒pHEP-3.0-M^min基因组的G基因和L基因之间再插入一个拷贝的G基因；

S3.利用重组质粒pHEP-dG-M^min进行拯救获得重组病毒rHEP-dG-M^min。

3.根据权利要求2所述的重组狂犬病病毒rHEP-dG-M^min，其特征在于，步骤S1构建重组质粒pHEP-3.0-M^min的具体方法如下：

S11.利用引物M-min-F/M-min-R扩增序列如SEQ ID NO.2所示的去优化后M基因，得到M-min片段；并利用引物vHEP-3.0-F/vHEP-3.0-R线性化载体pHEP-3.0；

其中，引物M-min-F/M-min-R的序列分别如SEQ ID NO.3和4所示，引物vHEP-3.0-F/vHEP-3.0-R的序列分别如SEQ ID NO.5和6所示；

S12.利用无缝克隆技术连接M-min片段与线性化载体pHEP-3.0，获得携带去优化M基因的狂犬全长cDNA的重组质粒pHEP-3.0-M^min。

4.根据权利要求3所述的重组狂犬病病毒rHEP-dG-M^min，其特征在于，步骤S11所述pHEP-3.0质粒是携带HEP-Flury毒株全长cDNA的重组质粒。

5.根据权利要求3所述的重组狂犬病病毒rHEP-dG-M^min，其特征在于，步骤S2构建重组质粒pHEP-dG-M^min的具体方法如下：

S21.利用引物RV-G-F/RV-G-R对质粒pHEP-3.0进行PCR扩增，并且两端添加BsiWⅠ和NheⅠ酶切位点，得到狂犬病病毒G基因片段；

其中，引物RV-G-F/RV-G-R的序列分别如SEQ ID NO.7和8所示；

S22.将G基因片段和重组质粒pHEP-3.0-M^min分别利用BsiWⅠ和NheⅠ进行双酶切；两者的酶切产物连接获得重组质粒pHEP-dG-M^min。

6.权利要求1～5任一所述重组狂犬病病毒rHEP-dG-M^min在制备狂犬病疫苗方面的应用。

7.权利要求1～5任一所述重组狂犬病病毒rHEP-dG-M^min在去优化M基因对狂犬病毒复制与转录的机理研究中的应用。