[发明专利]绿色木霉生产纤维素酶的方法及所产纤维素酶的应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种绿色木霉生产纤维素酶的方法及所产纤维素酶的应用。

背景技术

近年来，全球能源需求日益增加、石油煤炭的储备量日益减少、环境破坏日益严重，人类急需可再生能源，而木质纤维素来源是地球上最丰富、最低廉的可再生能源。在地球上，每年依靠光合作用产生近2000亿吨的植物生物量中植物纤维素占绝大多数，但其中89％还没有被人们开发利用，用在农肥、纺织、建筑、造纸、燃料等方面的只有一小部分，大部分没有被利用而被废弃燃烧，不仅造成资源的巨大浪费还污染了环境。目前木质纤维素的利用率极低，只有加快木质纤维素的综合开发利用，才能使世界各国的能源和环境问题在很大程度上得到缓解。由此可见，纤维素是一种很有研究价值的资源，在以后纤维素的综合开发利用是各国科学家研究的重点以及发展趋势。

纤维素(Cellulose)：是植物细胞壁中最重要的成分之一，由D-吡喃葡萄糖基以β-1，4糖苷键连接而成的线性高分子聚合物，其化学式可表示为C_m(H₂O)_n。组成纤维素的葡萄糖溶解度很高，但纤维素分子性质很稳定，溶解度很小。通过对微纤丝晶体结构的研究发现：原纤维由规范而有序的结晶区和疏松、相对不规则的非定形区组成，其结晶度一般在30％-80％之间。结晶区所在的区域是纤维素β-1，4-D-葡聚糖区域；非结晶区则是木糖或甘露糖存在的区域，也就是说纤维素是一个二相体系——结晶区与非结晶区交错连接形成。结晶区具有高度的稳定性，结构非常牢固，很难与反应试剂(酸、碱或纤维素酶)接触，是木质纤维素发酵产乙醇存在的共性技术难题。为了提高纤维素更高的利用率，破坏纤维素的结晶结构是研究内容的重中之重。在一般的植物细胞壁中，纤维束是纤维素的存在形式，果胶质粘合在不同细胞的细胞壁之间，这使得细胞壁的纤维素降解难度增大。

纤维素酶以不同作用主要分为三类：(1)葡聚糖内切酶(EC 3.2.1.4，endo-1,4-β-D-glucanase，EG)：也称为CMCases，可以任意水解β-1，4糖苷键的连接，也可以结合于纤维素链内部的非结晶区域里。切断纤维素链可产生非还原端的小分子纤维素，但这种小分子纤维素遇到结晶区的纤维素则不起作用；(2)葡聚糖外切酶(EC 3.2.1.91，exo-1,4-β-D-glucanase，CBH)：或称微晶纤维素酶或C1分子，在天然纤维素的降解过程中葡聚糖外切酶起着很重要的作用，同时它也是纤维素酶系中的重要组分，葡聚糖外切酶使得纤维素链的末端水解β-1，4糖苷键，生成纤维二糖和纤维寡糖；(3)β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21，β-1,4-glucosidase，BG)：β-葡萄糖苷酶将可溶性的纤维寡糖或纤维二糖水解成葡萄糖，也称纤维二糖酶，纤维二糖对外切葡聚糖酶和内切葡聚糖酶具有很高的抑制作用，而β-葡萄糖苷酶可以消除这种反馈抑制作用，提高了纤维素酶的降解效率，这点在纤维素的降解过程中有着很重要的地位。

纤维素酶在蜗牛的消化道中被科学家发现以后，纤维素在微生物降解的问题上就受到世界科学家们较大的关注。美军的Natick实验室随后就已经研究了有关微生物降解在军用纤维素材料方面的防护问题，在后来研究中发现纤维素除了能够被微生物降解以外，生产出来的生产原料也十分丰富经济，自然界中不断产生的固体废物问题也有望能够得到解决。在此以后，纤维素酶得到了更为广泛的关注。纤维素酶在食品加工、化工生产、医药保健、酿造行业、饲料生产、农副产品深加工、环境保护等领域有着非常广阔的应用前景和十分深厚的潜力。纤维素酶在分解纤维素时起生物催化作用，可以将纤维素分解成寡糖或单糖的蛋白质。然而，纤维素酶存在产生菌的产酶能力低，而且所产生的酶的组分不完整或不平衡等问题，纤维素酶作用的机制至今尚未被研究得完全清楚的重要原因，也是实际的应用和研究存在距离较大的最为主要的原因。

在腐烂的种子、木材以及植物的残体中可以筛选出绿色木霉。绿色木霉能产生木聚糖酶、纤维素酶和几丁质酶等多种具有生物活性的酶系。在自然界中，它通常能产生很高的纤维素酶活性，该纤维素酶有着显著的降解作用，绿色木霉属于拮抗微生物，可有效防治土传性病害。绿色木霉具有菌体生长较快，分泌的纤维素酶稳定性较好、周期短的优点，同时所产的纤维素酶是胞外酶，易于分离纯化，而且该酶及其代谢产物安全稳定不会对人和环境造成影响。这些优点使得绿色木霉成为发酵产纤维素酶常用的菌种之一。然而现有技术中，绿色木霉产纤维素酶还存在工艺步骤繁琐、产量较低、成本较高等缺点，制约了绿色木霉在生产纤维素酶上的发展与利用。

发明内容