[发明专利]一种特异性敲除二氢叶酸还原酶基因的sgRNA序列及其应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种特异性敲除二氢叶酸还原酶基因的sgRNA序列及其应用。

背景技术

中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cell，CHO细胞)是目前生产药物蛋白最常用的宿主细胞，其表达产物在分子结构、理化性质和生物学功能等方面接近天然蛋白，被广泛应用于抗体、重组蛋白药物和疫苗等产品的研发和生产中，提高CHO细胞中表达产物的产量是研究者们长期的追求。

二氢叶酸还原酶(dihydrofolate reductase，DHFR)是一种催化5，6-二氢叶酸还原为5，6，7，8-四氢叶酸的蛋白酶，参与细胞内的嘌呤代谢过程。当细胞株缺失了DHFR基因，将携带DHFR基因的表达载体转染细胞，阳性细胞也就获得了DHFR基因，此时在培养基中加入甲氨喋呤(Methotrexate，MTX)，会导致DHFR基因扩增，连带其两侧片段也得到相应扩增，可使目的基因的拷贝数增加几百到几千倍，从而达到目的基因的高效表达。因此，急需要敲除CHO细胞株的DHFR基因，以提高外源基因蛋白表达量。

Crispr/Cas9系统，是细菌和古细菌在进化过程中演变出来的一种用于抵御外来侵害的免疫入侵系统，在现代基因工程应用领域与TALEN(transcription activator-like effector nuclease)以及ZFN(zinc-finger nuclease)技术并列成为三大基因组编辑工具。CRISPR-Cas9技术具有特异性DNA识别能力，Cas9核酸内切酶在向导核糖核酸(guide RNA，sgRNA)引导下切割双链DNA，造成基因组双链断裂，利用细胞基因组修复的不稳定性产生非特异重组来产生修复错误(插入或者缺失)，从而可能产生移码突变而造成基因功能的丧失，实现基因敲除的目的。相比较于TALEN及ZFN技术，其sgRNA的设计和合成工作量远远小于TALEN和ZFN识别模块的构建过程，易于操作，而且毒性低、效率更高、更容易得到纯合子突变体。

现有报道中，仅见Sigma公司利用ZFN技术敲除DHFR，构建DHFR-/-型的CHO细胞系，细胞毒性较大。设计出特异性靶向敲除DHFR基因的sgRNA，利用CRISPR-Cas9系统构建DHFR-/-型的CHO细胞系，对外源蛋白高效表达意义重大。

发明内容

本发明的目的在于提供一种sgRNA序列及其应用。

本发明提供了一种特异性敲除二氢叶酸还原酶基因的sgRNA序列，序列如SEQ ID NO：3所示。

本发明还提供了一种核苷酸序列，序列如SEQ ID NO：11所示。

本发明还提供了一种重组质粒，它包括SEQ ID NO：3或11所示的序列。

本发明还提供了上述序列在敲除二氢叶酸还原酶基因中的用途。

本发明还提供了上述序列在制备二氢叶酸还原酶基因缺失细胞株中的用途。

本发明还提供了一种用于敲除二氢叶酸还原酶基因的试剂盒，它包括上述sgRNA序列或重组质粒。

本发明还提供了一种敲除CHO细胞中二氢叶酸还原酶基因的方法，它是利用CRISPR/Cas9系统在CHO细胞中对二氢叶酸还原酶基因进行改造，步骤如下：

a、合成上述序列及其互补链，变性、退火，形成双链；

b、将步骤a制备的双链插入到Cas9表达载体的多克隆位点，得到重组表达质粒；

c、将步骤b的重组表达载体转染CHO细胞，挑取单个细胞，接种培养；

d、待单个细胞增殖为单克隆后，鉴定并确认CHO细胞中的二氢叶酸还原酶基因被敲除，并获得二氢叶酸还原酶基因缺失的CHO细胞。

其中，所述CHO细胞为CHO-S亚型细胞。

其中，所述Cas9表达载体为CRISPR/Cas9载体。

本发明还提供了上述方法制备得到的二氢叶酸还原酶基因缺失细胞株。

本发明提供的特异性靶向敲除二氢叶酸还原酶基因的sgRNA，能够引导Cas9快速、高效、特异性敲除CHO细胞中的DHFR基因，实现了在基因组水平对DHFR基因的沉默；获得的DHFR基因缺失细胞株，与野生型CHO-S细胞的细胞形态和生长特性相同，可大大提高外源蛋白的产量，为产业化生产重组蛋白提供了良好基础。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。