[发明专利]一种特异性敲除二氢叶酸还原酶基因的sgRNA序列及其应用

权利要求书

1.一种特异性敲除二氢叶酸还原酶基因的sgRNA序列，其特征在于，序列如SEQ ID NO：3所示。

2.一种核苷酸序列，其特征在于，序列如SEQ ID NO：11所示。

3.一种重组质粒，其特征在于，它包括SEQ ID NO：3或11所示的序列。

4.权利要求1所述的sgRNA序列或权利要求2所述的核苷酸序列在敲除二氢叶酸还原酶基因中的用途。

5.权利要求1所述的sgRNA序列或权利要求2所述的核苷酸序列在制备二氢叶酸还原酶基因缺失细胞株中的用途。

6.一种用于敲除二氢叶酸还原酶基因的试剂盒，其特征在于，它包括权利要求1所述的sgRNA序列或权利要求2所述的核苷酸序列或权利要求3所述的重组质粒。

7.一种敲除CHO细胞中二氢叶酸还原酶基因的方法，其特征在于，它是利用CRISPR/Cas9系统在CHO细胞中对二氢叶酸还原酶基因进行改造，步骤如下：

a、合成SEQ ID NO：3或11所示的序列及其互补链，变性、退火，形成双链；

b、将步骤a制备的双链插入到Cas9表达载体的多克隆位点，得到重组表达质粒；

c、将步骤b的重组表达载体转染CHO细胞，挑取单个细胞，接种培养；

d、待单个细胞增殖为单克隆后，鉴定并确认CHO细胞中的二氢叶酸还原酶基因被敲除，并获得二氢叶酸还原酶基因缺失的CHO细胞。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述CHO细胞为CHO‐S亚型细胞。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述Cas9表达载体为CRISPR/Cas9载体。

10.权利要求7‐9任意一项所述方法制备得到的二氢叶酸还原酶基因缺失细胞株。