[发明专利]黄曲霉毒素B1适配体亲和毛细管整体柱的制备及应用

说明书

本发明公开了一种黄曲霉毒素B1适配体亲和毛细管整体柱的制备及应用，将氨基修饰的黄曲霉毒素B1适配体通过戊二醛偶联接枝修饰于有机‑无机杂化的氨基毛细管整体柱，通过适配体与黄曲霉毒素B1特异性亲和作用，有机‑无机杂化整体柱高的柱渗透性和大的比表面积，可以高灵敏、高选择性地分离、富集复杂食品样品中痕量、超痕量黄曲霉毒素B1，与检测仪器联用可实现黄曲霉毒素B1简便、灵敏、快速检测。

技术领域

本发明涉及黄曲霉毒素B1的分离富集方法，具体涉及一种黄曲霉毒素B1适配体亲和毛细管整体柱的制备方法及应用。

背景技术

黄曲霉毒素B1（AFB1）是主要由黄曲霉和寄生曲霉等产生的一种有毒代谢产物，已被国际癌症研究机构(IARC)定为一级致癌物。黄曲霉毒素B1广泛分布于各类农产品和食品中，其中最易受到污染的主要有花生、玉米、稻谷、小麦、花生油等粮油食品。鉴于AFB1的严重危害性，国内外相关组织对其制定了严格的限量标准。

目前黄曲霉毒素B1的检测方法主要有薄层色谱法（TLC）、高效液相色谱法（HPLC）、液质联用法（LC-MS）、免疫分析法（IA）等。在众多的方法中，HPLC由于操作简单，准确可靠，重复性好，已成为实验室内黄曲霉毒素B1的主要检测方法。但是由于农产品和食品样品基体复杂，在采用HPLC检测黄曲霉毒素B1时，需要对提取液有一个分离纯化的过程。由于相对高的亲和力和特异性，免疫亲和柱在分离纯化和检测分析中得到了广泛的应用。然而，在亲和色谱中，免疫抗体存在一些明显的局限性，（1）抗体在固定相上的固定化仍然具有一定的挑战性，固定的抗体在空间上的取向难以保持一致，影响抗体的亲和力；（2）抗体易受外界条件的影响，在强亲和力的亲和色谱模式下，分离富集操作过程中经常需要改变溶液的pH、添加有机溶剂或变性剂等，剧烈的洗脱条件，可能会导致抗体失活，在很大程度上限制了方法的灵活应用；（3）抗体由于体积大，在固定相表面的覆盖率小，导致免疫亲和柱容量比较小；（4）抗体制备需要经过免疫动物实验或细胞实验、繁琐费时、成本高。

发明内容

本发明的目的是针对上述问题，提供一种黄曲霉毒素B1适配体亲和毛细管整体柱，将氨基修饰的黄曲霉毒素B1适配体通过戊二醛偶联接枝修饰于有机-无机杂化的氨基毛细管整体柱，用于待测样品中黄曲霉毒素B1的高选择性分离与富集。

本发明的技术方案如下：一种黄曲霉毒素B1适配体亲和毛细管整体柱的制备方法，包括如下步骤：

（1）毛细管活化：用于制备整体柱的石英毛细管内径为530μm，外径为690μm。分别用1.0mol/L氢氧化钠溶液冲洗毛细管4h，去离子水冲洗30min，1.0mol/L盐酸溶液冲洗4h，然后再以去离子水洗至中性，在160℃下用氮气吹干。

（2）整体柱的原位合成：首先将10~30mg CTAB溶于150~350μL无水乙醇和50~150μL去离子水的混合溶液中。然后将100~200μL TEOS和50~100μL APTES快速加入上述混合溶液中。室温涡旋0.5~5min，然后放置在-5~5℃的水浴中超声0.5~5min后，将混合溶液灌入上述活化处理过的毛细管中。最后，毛细管两端以硅橡胶封口，放置于30~60℃烘箱中反应10~30h。

（3）整体柱的清洗：反应完成后，以甲醇和水充分清洗毛细管。

（4）戊二醛衍生：将含有5~20%戊二醛的磷酸缓冲溶液以5~20μL/min速率通入毛细管整体柱中，连续反应12h，然后用磷酸缓冲溶液冲洗掉残留的戊二醛。

（5）修饰适配体：将黄曲霉毒素B1适配体制成浓度为4~8nmol/L的磷酸缓冲溶液，注入毛细管整体柱中反应8~12h，重复三次，用磷酸缓冲溶液冲洗掉未反应的适配体。最后用3~8mg/ml氰基硼氢化钠冲洗整体柱6h，将制得的毛细管整体柱截取5 cm的长度用于之后的固相微萃取操作。

上述的毛细管整体柱在分离富集黄曲霉毒素B1中的应用。