[发明专利]一种测定孔雀石绿的免疫荧光检测卡及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及免疫荧光分析技术领域，具体涉及一种测定孔雀石绿的免疫荧光检测卡及其制备方法与应用。

背景技术

孔雀石绿(Malachite Green，MG)是一种人工合成的有机染料，曾被广泛用于预防和治疗各类水产动物的水霉病、鳃霉病和小瓜虫病等。但由于孔雀石绿及其代谢产物无色孔雀石绿在水产品体内会产生高残留，人食用后易引起致癌、致畸和致突变等副作用。欧盟、美国等国家均已禁止将孔雀石绿用作渔类的抗菌药，我国于2002年5月也将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》中。目前，用于孔雀石绿残留检测的主要方法是仪器分析法，因其样品前处理过程繁琐费时，检测费用高，不利于广泛应用。

免疫荧光分析技术是在免疫标记技术中逐渐发展起来的一种以荧光物作为标记物应用于抗原-抗体反应的分析技术。使用免疫荧光分析技术可以用来检测抗原，也可用来检测抗体。其中用于检测抗原的方法较为常用，通常称其为荧光抗体法。

用荧光微球作为标记物，每个微球中可以包裹成千上万个荧光分子，从而可以提高标记的效率，有效的提高了检测灵敏度；同时在荧光微球表面修饰有适宜密度的羧基，用于与蛋白或抗体的共价偶联，提高标记物的稳定性。与传统的胶体金标记法不同，应用荧光免疫分析技术进行检测时，其信号特异性强、灵敏度高，特别适合于现场快速检测。

免疫层析技术又称侧向流动技术，是以固相试纸条为载体的抗原-抗体免疫分析技术。一般试纸条由样品垫、偶联物垫、硝酸纤维素膜和吸水垫组成。其中的样品垫和结合垫均为玻纤纸，样品垫为待测样品起始流动区，偶联物垫为标记物吸附区，硝酸纤维素膜一般由检测线和质控线构成，是免疫分析的反应区，吸水垫为层析液的流动提供虹吸动力。免疫层析技术最大的优点就是检测速度快，一般检测用时10-15min，不需要大型仪器设备，可用于现场检测。

但是目前检测孔雀石绿的检测卡和检测方法均存在灵敏度不够的问题，需要提供一种灵敏度更高的检测卡和检测方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种灵敏度高的测定孔雀石绿的免疫荧光检测卡及其制备方法与应用。

本发明所采取的技术方案是：

一种测定孔雀石绿的免疫荧光检测卡，包括垫板，还包括附于所述垫板上且依次紧密相连的样品垫、耦联物垫、反应膜和吸水垫，所述耦联物垫上荧光微球标记的孔雀石绿抗体，所述反应膜上设有检测线和质控线，所述检测线靠近所述耦联物垫，所述质控线靠近所述吸水垫，所述检测线上包被有孔雀石绿抗原，所述质控线上包被有识别孔雀石绿抗体的二抗。

在一些优选的实施方式中，所述免疫荧光检测卡还包括上外壳和下外壳，所述上外壳盖于所述样品垫、所述耦联物垫、所述反应膜和所述吸水垫上方，所述下外壳设于所述垫板的下方，所述上外壳和所述下外壳相互盖合，所述上外壳在对应所述样品垫的位置开设有加样孔，所述上外壳在对应所述反应膜的位置设有观察窗。

此外，本发明还提供了一种如上所述的测定孔雀石绿的免疫荧光检测卡的制备方法，包括以下步骤：

制备样品垫；

制备耦联物垫：裁剪耦联物垫膜，取荧光微球标记的孔雀石绿抗体喷涂在所述膜上，干燥；

制备反应膜：取反应膜，在所述反应膜上喷涂孔雀石绿抗原溶液，形成检测线，在所述反应膜上喷涂识别孔雀石绿抗体的二抗溶液，形成质控线；

组装检测卡：取吸水垫和垫板，在所述垫板上依次搭接粘贴所述样品垫、所述耦联物垫、所述反应膜和所述吸水垫。

在一些优选的实施方式中，所述荧光微球标记的孔雀石绿抗体的制备方法包括以下步骤：

(1)荧光微球活化：将待活化的荧光微球加入缓冲液中，洗涤，固液分离，弃去上清液，收集固体物质复溶于缓冲液中，向所述缓冲液中加入N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，振荡反应，固液分离，收集固体物质并溶解于PB缓冲液中，得到荧光微球溶液；

(2)抗体标记：取孔雀石绿抗体溶于PBS缓冲液中，并将其加入所述荧光微球溶液中，振荡反应一段时间，加入乙醇胺振荡反应一段时间，再加入牛血清白蛋白溶液，封闭反应一段时间，固液分离，收集固体物质用PB缓冲液重新悬浮，得到荧光微球标记的孔雀石绿抗体。

在进一步优选的实施方式中，向所述缓冲液中加入的N-羟基琥珀酰亚胺与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的质量比为1：1。

在进一步优选的实施方式中，所述孔雀石绿抗体是以孔雀石绿半抗原与载体蛋白的偶联物为抗原获得。