[发明专利]一种测定孔雀石绿的免疫荧光检测卡及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种测定孔雀石绿的免疫荧光检测卡，包括垫板，其特征在于，还包括附于所述垫板上且依次紧密相连的样品垫、耦联物垫、反应膜和吸水垫，所述耦联物垫上荧光微球标记的孔雀石绿抗体，所述反应膜上设有检测线和质控线，所述检测线靠近所述耦联物垫，所述质控线靠近所述吸水垫，所述检测线上包被有孔雀石绿抗原，所述质控线上包被有识别孔雀石绿抗体的二抗。

2.根据权利要求1所述的测定孔雀石绿的免疫荧光检测卡，其特征在于，所述免疫荧光检测卡还包括上外壳和下外壳，所述上外壳盖于所述样品垫、所述耦联物垫、所述反应膜和所述吸水垫上方，所述下外壳设于所述垫板的下方，所述上外壳和所述下外壳相互盖合，所述上外壳在对应所述样品垫的位置开设有加样孔，所述上外壳在对应所述反应膜的位置设有观察窗。

3.一种如权利要求1或2任一项所述的测定孔雀石绿的免疫荧光检测卡的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

制备样品垫；

制备耦联物垫：裁剪耦联物垫膜，取荧光微球标记的孔雀石绿抗体喷涂在所述膜上，干燥；

制备反应膜：取反应膜，在所述反应膜上喷涂孔雀石绿抗原溶液，形成检测线，在所述反应膜上喷涂识别孔雀石绿抗体的二抗溶液，形成质控线；

组装检测卡：取吸水垫和垫板，在所述垫板上依次搭接粘贴所述样品垫、所述耦联物垫、所述反应膜和所述吸水垫。

4.根据权利要求3所述的测定孔雀石绿的免疫荧光检测卡的制备方法，其特征在于，所述荧光微球标记的孔雀石绿抗体的制备方法包括以下步骤：

(1)荧光微球活化：将待活化的荧光微球加入缓冲液中，洗涤，固液分离，弃去上清液，收集固体物质复溶于缓冲液中，向所述缓冲液中加入N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，振荡反应，固液分离，收集固体物质并溶解于PB缓冲液中，得到荧光微球溶液；

(2)抗体标记：取孔雀石绿抗体溶于PBS缓冲液中，并将其加入所述荧光微球溶液中，振荡反应一段时间，加入乙醇胺振荡反应一段时间，再加入牛血清白蛋白溶液，封闭反应一段时间，固液分离，收集固体物质用PB缓冲液重新悬浮，得到荧光微球标记的孔雀石绿抗体。

5.根据权利要求4所述的测定孔雀石绿的免疫荧光检测卡的制备方法，其特征在于，向所述缓冲液中加入的N-羟基琥珀酰亚胺与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的质量比为1：1。

6.根据权利要求4所述的测定孔雀石绿的免疫荧光检测卡的制备方法，其特征在于，所述孔雀石绿抗体是以孔雀石绿半抗原与载体蛋白的偶联物为抗原获得。

7.根据权利要求6所述的测定孔雀石绿的免疫荧光检测卡的制备方法，其特征在于，所述孔雀石绿半抗原的制备包括以下步骤：称取3-硝基苯甲醛和N,N-二甲基苯胺，混合，向其中加入浓硫酸，加热反应一段时间，将反应液转入碳酸钠溶液中，用乙酸乙酯萃取，取有机相用饱和食盐水洗涤，再去除有机相中溶解的水，抽滤得到固体物质，过硅胶柱层析，以乙酸乙酯/正己烷混合液为展开剂，得到第一中间产物，称取所述第一中间产物，向其中加入四氢呋喃、甲醇和钯碳，减压除空气，室温加氢放置，得到第二中间产物，称取所述第二中间产物，将其加入到无水吡啶中，再加入戊二酸酐，室温搅拌，浓缩干吡啶，加入乙酸乙酯和水，水相用乙酸乙酯萃取，合并有机相，取有机相用饱和食盐水洗涤，再去除有机相中溶解的水，抽滤，得到孔雀石绿半抗原。

8.根据权利要求6所述的测定孔雀石绿的免疫荧光检测卡的制备方法，其特征在于，所述载体蛋白为牛血清白蛋白。

9.根据权利要求4-8任一项所述的测定孔雀石绿的免疫荧光检测卡的制备方法，其特征在于，所述孔雀石绿抗体的制备包括以下步骤：以孔雀石绿半抗原与载体蛋白的偶联物为抗原，用所述抗原免疫小鼠，将免疫鼠的脾脏细胞与鼠源骨髓瘤细胞融合，筛选，得到分泌孔雀石绿单克隆抗体的杂交瘤细胞株，通过制备腹水得到孔雀石绿抗体。

10.一种采用权利要求1或2所述的测定孔雀石绿的免疫荧光检测卡进行孔雀石绿检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将待测定样品加到所述样品垫上，进行免疫反应；

(2)将测定孔雀石绿的免疫荧光检测卡置于荧光读卡仪上，对荧光信号的强度进行读取；

(3)结果的判断：当所述检测线和所述质控线在345nm激发光照射下同时显示橙色荧光，且所述检测线较所述质控线深或两者颜色相同或相近，即表示检测结果为阴性，说明检测物中不含有孔雀石绿或所含孔雀石绿浓度小于0.1ng/mL；当所述检测线和所述质控线在345nm激发光照射下，所述质控线显示橙色荧光，而所述检测线不显荧光或较所述质控线显色浅，即表示检测结果为阳性，说明检测物中含有孔雀石绿且浓度大于0.1ng/mL。