[发明专利]一种血清中免疫球蛋白G糖肽的绝对定量分析方法

说明书

本发明提供了一种绝对定量血清中免疫球蛋白G(IgG)糖肽的定量方法。工艺过程包括血清中IgG糖肽的释放，色谱法对IgG糖肽的富集。将收集到的IgG糖肽分成二份，一份进行IgG糖肽中各种糖型Profiling分析；另一份IgG糖肽进行PNGase F酶解，对去糖基化的IgG肽段进行MRM定量分析；结合Profiling结果计算IgG各种糖型对应糖肽含量。本发明方法可以测量血清中IgG各亚型上每种糖肽的摩尔浓度，方法灵敏度高，精密度好，准确率高，回收率高，可操作性好，适合血清中IgG糖肽高通量绝对定量研究。

技术领域

本发明涉及定量人血清中免疫球蛋白G糖肽的质谱绝对定量方法开发，属于蛋白质组学的技术领域。

背景技术

免疫球蛋白(Immunoglobulin，Ig)是一类可溶性血清糖蛋白，具有抗体活性。根据重链性质差异可分为五种，包括IgG，IgM，IgA，IgE和IgD。其中，IgG是血清主要的抗体成分，约占血清免疫球蛋白总量的75％。IgG包含四种亚型：IgG1～4其IgG1占60～70％，IgG2占15～20％，IgG3占5～10％，IgG4占1～7％(Mathiesen T,Hammarstrom L,Fridell E,etal.Aberrant IgG subclass distribution to measles in healthy seropositiveindividuals,in patients with SSPE and in immunoglobulin-deficient patients[J].Clin Exp Immunol,1990,80(2):202-5)。IgG由Fc(结晶段)和Fab(抗原结合段)组成，均含有保守的N-糖基化修饰。研究表明，IgG N-糖基化修饰与许多疾病(如：癌症、类风湿性关节炎和炎症性疾病)的发生发展有关。此外，一类以IgG结构为基础的大分子糖蛋白药物(单克隆抗体药物)，为癌症、自身免疫疾病以及病毒感染等的治疗提供了全新的途径，其糖基化修饰类型及水平对其稳定性、清除效率、免疫原性、抗体依赖细胞毒性及补体依赖细胞毒性等都有一定的作用(Beck A,Wagner-Rousset E,Ayoub D,et al.Characterizationof therapeutic antibodies and related products[J].Anal Chem,2013,85(2):715-736)。由此可见，对IgG糖基化修饰的定性、定量研究对疾病的监测诊断有重要意义，同时对治疗性抗体的生产控制提供新思路。

目前，对于IgG糖基化水平定量分析主要在糖链水平和糖肽水平。糖链水平定量策略是：糖链的释放、荧光标记、分离分析，常用定量分析方法是UPLC-FLR(超高效液相-荧光检测)、HPAEC-PAD(高效阴离子色谱-脉冲检测)和CGE-LIF(毛细管凝胶电泳-激光诱导荧光检测)。其中CGE-LIF缺点是对未知糖链无法定量，需进一步质谱分析未知糖链，质谱鉴定过程需要对糖链进行特定衍生化，此法步骤繁琐；HPAEC-PAD克服上述缺点，但灵敏度和选择性较LC低。基于以上原因，LC-MS(如Q-TOF,IT或Orbitrap)方法被广泛应用于糖链定量研究中。上述方法需对糖链先进行释放，因此对糖链来源及位点信息并不明确，此外标记步骤繁琐，未能达到临床及药物分析发展需要。为解决上述问题，发展糖肽水平定量分析常用方法是LC-ESI-MS(电喷雾质谱)和MALDI-TOF-MS(基质辅助激光解离质谱)。其中MRM技术被认为是分析复杂样品中低丰度化合物最可靠且最有潜力的定量方法。可以在三重四级杆质谱上实现，第一个和第三个四级杆让预先选定的母离子和子离子分别通过，第二个四级杆为碰撞池，因此它具有很高选择性。此外，MRM这种非扫描模式还有很高的灵敏度以及很宽的线性范围，这些特性使得MRM更适合定量分析复杂体系的低丰度化合物。优点是稳定好、分析时间短、灵敏度高、特异性好。此方法缺点在于需要预先知道母离子及其在高能诱导解离信息。由于糖肽标准品缺乏，常用氧鎓离子(荷质比为244、366和292等)作为碎片离子来构建糖肽定量离子对。