[发明专利]一种血清中免疫球蛋白G糖肽的绝对定量分析方法

权利要求书

1.血清中免疫球蛋白G糖肽绝对定量方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)血清酶解：用缓冲溶液将血清稀释，然后加入二硫苏糖醇进行二硫键还原，反应产物中加入碘代乙酸，得到反应液，将反应液中加入胰蛋白酶进行酶解反应；

2)免疫球蛋白G糖肽富集：酶解液进行一维色谱富集，经nano-ESI-Q-TOF分析，洗脱得到免疫球蛋白G糖肽组分；将收集的免疫球蛋白G糖肽分成两份；

3)免疫球蛋白G糖肽Profiling分析：将步骤2)中收集的免疫球蛋白G糖肽中的一份进行HPLC-MRM分析：将免疫球蛋白G亚型中各糖肽峰面积归一化到与其对应亚型总糖肽峰面积之和，即可得到免疫球蛋白G亚型中各糖肽占该亚型总糖肽的百分比；

4)糖链释放：将步骤2)中收集的免疫球蛋白G糖肽另一份进行PNGase F酶解反应，从而得到去糖基化的免疫球蛋白G肽段酶解液；

5)去糖基化免疫球蛋白G肽段HPLC-MRM定量分析：将步骤4)中免疫球蛋白G糖肽的PNGase F酶解液进行HPLC-MRM定量分析；具体地，先建立免疫球蛋白G亚型的内标曲线；

采用所述免疫球蛋白G亚型的一种或两种以上亚型，在上述一种或两种以上亚型中选取各亚型中的任一糖肽对应肽段作为标准品，即1～4个标准品，一起稀释成至少5个不同浓度，浓度范围为20ppb-200ppm，每个浓度的标准品均加入1ppm～4ppm与各标准品等体积的与亚型对应的内标肽段，所述内标肽段与标准品的区别在于内标肽段在上述液相分离条件下具有与标准品相似保留行为；而后进行HPLC-MRM定量分析，建立与上述亚型对应的内标曲线，曲线纵坐标为上述不同浓度的标准品峰面积与对应的内标肽段峰面积的比值，横坐标为上述标准品的摩尔浓度；

而后，将步骤4)酶解液中加入与该酶解液等体积的1ppm～4ppm所述内标肽段，进行HPLC-MRM定量分析，测定步骤4)酶解液中免疫球蛋白G亚型中与标准品对应的肽段峰面积与对应的内标肽段峰面积的比值，将此比值带入内标曲线，得到该亚型总肽段摩尔浓度，即为该免疫球蛋白G亚型总糖肽的摩尔浓度；

6)免疫球蛋白G亚型中每种糖肽浓度计算：将步骤3)中得到的免疫球蛋白G亚型中各糖肽占亚型总糖肽的百分比，与步骤5)中得到的免疫球蛋白G亚型总糖肽的摩尔浓度的乘积，即为一种或两种以上免疫球蛋白G亚型中的各糖肽的摩尔浓度。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤1)将血清稀释并加入二硫苏糖醇进行二硫键还原反应，反应温度在37-90℃之间，反应时间在50-180min；加入碘代乙酸反应温度在20-30℃之间，反应时间在30-60min；加入胰蛋白酶后反应温度在35-40℃之间，反应时间在18-72h。

步骤1)血清酶解稀释所使用的缓冲溶液为碳酸氢铵缓冲溶液，稀释所用缓冲液浓度在50-400mM，pH为7-8，加入原溶液体积的1-3倍体积的缓冲溶液；加入二硫苏糖醇的浓度在0.3-0.6M，血清总蛋白与二硫苏糖醇的质量比例为7:1-3:1；加入碘代乙酸的浓度在0.3-0.6M，血清总蛋白与碘代乙酸的质量比为5.5:1-2.7:1；加入胰蛋白酶和血清总蛋白的质量比为1:50-1:20；酶解后，加入1％-5％(v/v)甲酸终止酶解反应。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤2)富集所用色谱柱为C18色谱柱；所用色谱柱键合材料的粒径为5-10微米，流动相为甲醇与水或乙腈与水，两相中均含有或不含有0.1％(v/v)甲酸；洗脱条件按照水相95-70％(v/v)等度或5-60分钟水相由98％(v/v)变化到70％(v/v)线性梯度进行；使用紫外检测器，检测波长为190-280nm；柱温为25-35℃，洗脱液流速为0.6-1.2mL/min，收集保留时间为5-15min的组分；

步骤2)免疫球蛋白G糖肽富集时采用最佳流动相为乙腈和水，两相中均含或不含0.1％(v/v)甲酸，等度洗脱，水在流动比例为98-80％(v/v)。

4.根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤2)免疫球蛋白G富集到的糖肽馏分采用nano-ESI-Q-TOF-MS直接进样检测，正离子模式，喷雾电压2.5kV，扫描范围500-2000，流速1μL/min，进样5μL。