[发明专利]一种为肺癌提供离体个体化药物测试的方法及培养基

说明书

技术领域

本发明属于细胞生物学与药理学领域，涉及一种为肺癌提供离体个体化药物测试系统的建立及培养基。

背景技术

肺癌是中国和世界范围内最常见也是死亡率最高的恶性肿瘤，是危害人类健康的头号杀手。肺癌按病理分型可分为非小细胞肺癌（NSCLC）和小细胞肺癌（SCLC），约占所有肺癌的80%和20%。非小细胞肺癌中，鳞癌约占20%-35%，腺癌约占30%-45%。肺癌确诊时多数患者分期较晚是影响肺癌预后的重要原因，而早期肺癌可以通过多学科综合治疗实现较好的预后，可以得到更好的临床获益。NSCLC的肿瘤细胞生长速度及恶性程度均比SCLC低，但对放化疗不如SCLC敏感。化疗是晚期NSCLC综合治疗的重要手段，在肺癌的治疗中占有非常重要的地位，但有效率只有20-40％。肿瘤的多药耐药现象和临床上缺乏个体化治疗是导致化疗失败的重要原因。准确的化疗药物体外敏感性检测是制定个体化治疗方案的前提。因此如何针对性的选择化疗药物，避免无效治疗，降低患者痛苦，提高临床上的疗效日益受到越来越多科研人员和医学工作者的关注与重视。

有文献报道体外药敏的检测结果与临床治疗疗效的总体符合率约为80%，具有较高的敏感度和特异度，表明体外药敏试验与临床治疗敏感性有较好的相关性，且具有操作简易和经济可行等优势。然而体外药敏评价细胞模型也存在建立成功率低、肿瘤间质细胞混杂、无法长期培养等问题。一直以来受限于原代肿瘤细胞体外培养的技术，很难建立来源于肺癌患者的原发肿瘤细胞模型，因为这样的模型不仅需要能够在体外稳定培养，而且能反映出患者体内肿瘤细胞的特性，代表真正原发位点的肿瘤生物学特性，才能作为理想的体外药敏检测模型。从肿瘤的个体化治疗角度而言，只有在体外分离培养原代肿瘤细胞稳定传代后，才能进行更多更广泛的临床前药敏检测，结合临床经验设计药物剂量和药物组合，才能确定最优化的化疗使用方案安排临床治疗。

此外，抗肿瘤药尤其是化疗药引起的肺毒性反应严重影响患者的生存质量，甚至危及生命的化疗限制性毒性。抗肿瘤药相关肺损伤可涉及气道、胸膜、纵膈、肺血管，最常见的肺毒性是间质性肺疾病（ILD）。可致肺毒性的代表肿瘤药以博来霉素、甲氨蝶呤、丝裂霉素、马利兰、洛莫司汀为首。其他可能导致ILD的肿瘤药：阿糖胞苷、紫杉醇类、环磷酰胺、吉西他滨、伊立替康、奥沙利铂、长春碱、拓扑替康、多柔比星、依托泊苷，靶向药物如贝伐单抗、利妥昔单抗、曲妥珠单抗、厄洛替尼、吉非替尼。因此，增加对肺正常组织细胞的毒性评价显得尤为重要，也是未来的肺癌药敏试验个体化治疗需要优化之处。

综上所述，患者来源的癌细胞和癌旁正常细胞的培养一直以来是世界性的技术难题。如果能建立个体的肺原代上皮细胞和肺原代肿瘤细胞的体外长期培养体系，并利用该体系进行药敏检测，体外预测患者对常用化疗药物的敏感性和评价药物的安全性，将为肺癌精准化疗敏感药物的选择提供参考，尽可能地减轻毒性和副作用负担，最大限度地延长该肺癌患者的生存时间。

发明内容

为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种用于人或哺乳动物原代正常上皮细胞和原代肿瘤细胞培养的培养基及基于该培养基为肺癌提供稳定准确可靠的离体个体化药物测试的方法。

本发明的第一方面，提供一种用于培养人或哺乳动物的原代正常上皮细胞和原代肿瘤细胞的培养基M，所述培养基M成分包括：DMEM与Ham’s F-12 NUTRIENT MIX按体积比3:1混合的培养基，同时添加4-6％胎牛血清、1-3nM 三碘甲状腺氨酸（triiodothyronine）, 0.4-0.65％胰岛素-转铁蛋白-硒钠（insulin-transferrin-selenium）、5-20 uM Y-27632、9-11ng/mL表皮生长因子、0.3-0.5μg/mL氢化可的松、0.5-1.5nM霍乱毒素、0.4-0.6μg/mL两性霉素B、35-45μg/mL庆大霉素，激活素A（Activin A） 5-20 ng/ml及3ug/ml重组人R-Spondin-1。

本发明的第二方面，提供一种短期内快速增殖的肺癌病人肺上皮细胞和肿瘤细胞的原代分离培养和传代培养的方法，包括如下具体步骤：

A、肺癌和癌旁组织样本的取材及其样本储存运输

A1、样本标准：肺癌患者手术样本（适宜手术患者，切除的癌组织及癌旁组织样品至少1×1×1cm³）或活检、穿刺小样本（不适宜手术患者，纤支镜或CT引导经皮穿刺可获得的小样本），涵盖各临床分期；