[发明专利]一种为肺癌提供离体个体化药物测试的方法及培养基

权利要求书

1.一种用于培养人或哺乳动物的原代正常上皮细胞和原代肿瘤细胞的培养基M，其特征在于，所述培养基M成分包括：DMEM与Ham’s F-12 NUTRIENT MIX按体积比3:1混合的培养基，同时添加4-6％胎牛血清、1-3nM 三碘甲状腺氨酸, 0.4-0.65％胰岛素-转铁蛋白-硒钠、5-20μM Y-27632、9-11ng/mL表皮生长因子、0.3-0.5μg/mL氢化可的松、0.5-1.5nM霍乱毒素、0.4-0.6μg/mL两性霉素B、35-45μg/mL庆大霉素，激活素A 5-20 ng/ml及3μg/ml重组人R-Spondin-1。

2.一种肺癌病人肺上皮细胞和肺肿瘤细胞的原代分离培养和传代培养的方法，其特征在于，包括如下具体步骤：

A、肺癌和癌旁组织样本的取材及其样本储存运输：

A1、样本标准：肺癌患者手术样本至少1×1×1cm³或活检、穿刺小样本，涵盖各临床分期；

A2、样本储存运输：洁净室条件下，严格按照无菌操作标准，将手术样本或小样本收集保存于试管中，根据样本量大小添加样本收集液，一般为3-5mL，样本收集液为含2%青/链霉素和100ug/ml制霉菌素的PBS，样本可用于直接分离培养或长期液氮保存；样本直接分离培养时可先放置于4℃冰箱，但保存不宜超过48小时；样本储存于液氮前，需加入覆盖样本体积的冰浴后的PBS缓冲液清洗两次，每次10秒左右，用无菌镊子将清洗干净的样本放入新培养皿中，用眼科剪剪碎至米粒大小，加入1mL样本冻存液，移液器转移保存于细胞冻存管，放入程序降温盒中，-80℃冰箱过夜冷藏，次日可转移至液氮中长期储存；所述样本冻存液为胎牛血清（10099-141，Gibco）与二甲基亚砜（DMSO，(CH3)2SO）溶液按体积比为9:1配制；需要运输的样本在经过-80℃冰箱过夜冷藏后可放入体积合适的泡沫盒，加入足量的运输干冰，密封冰冻运输；

B、对来自于肺癌和癌旁组织样本的肺上皮细胞和肿瘤细胞的原代分离培养：

B1、分离培养前的实验室准备：使超净工作台处于开机状态，并打开紫外灯，工作30-60分钟后，关闭紫外灯，打开调风机调节风量大小，保证工作区内的风速始终处于理想状态后开始实验；准备五个60mm或100mm细胞培养皿（伽马射线消毒灭菌，无热源、无RNA酶、无DNA酶），标记为①②③④⑤，按照顺序摆放，在②号培养皿加入10mL无水乙醇（分析纯），③、④号培养皿分别加入冰浴的10mLPBS缓冲液；

B2、配制消化液：所述消化液为含0.2mg/mL胶原酶/透明质酸酶混合液的培养基M；

B3、样本直接分离培养：

B3.1、移去样本收集液将样本放置①号培养皿，依次在②号培养皿无水乙醇和③、④号培养皿PBS缓冲液清洗，然后分别将肺癌和癌旁组织样本放入⑤号无菌培养皿中，用无菌的眼科剪将组织尽可能剪碎，大小1-2mm³体积为宜，剪碎过程中滴加适量PBS缓冲液维持样本组织活性；

B3.2、在⑤号无菌培养皿中加入含步骤B2所配制消化液，分别消化剪碎后的肺癌和癌旁组织样本；

B3.3、分别将步骤B3.2处理后的肺癌和癌旁组织样本低速离心去除上清，速度为1000prm，时长为8分钟；

B3.4、分别将步骤B3.3处理后的肺癌和癌旁组织样本沉淀室温条件下重悬于2-5ml，浓度为0.25％胰酶/EDTA中消化；

B3.5、加入于胰酶/EDTA 2倍体积的含10%FBS的DMEM培养基终止消化，分别用无菌的一次性塑料枪头反复吹打肺癌和癌旁组织样本，时长为1分钟；

B3.6、分别用70 μm细胞筛过滤细胞悬液，收集过滤后的细胞悬液，1000prm低速离心，时长为10分钟去除上清；

B3.7、分别重悬步骤B3.6中的正常细胞沉淀和肿瘤细胞沉淀于PBS缓冲液中清洗，收集清洗后的细胞悬液，1000prm低速离心，时长为5分钟去除上清；

B3.8、分别重悬步骤B3.7中的正常细胞沉淀和肿瘤细胞沉淀于培养基M中，接种于培养瓶培养,静置培养36-48小时后显微镜观察拍照记录细胞克隆生长情况；

或者，

B3’、 当样本为运输样本和液氮储存样本时的分离培养

B3’.1、复苏时需要在40℃医用恒温水箱中快速溶解，经75%医用消毒酒精擦拭后生物传递窗传送至细胞培养室；

B3’.2、取15mL离心管加入适量PBS缓冲溶液，移液器移取溶解后的含样本的冻存液至离心管中，1000rpm低速离心5分钟，小心移去含冻存液的上清，并严格执行收到新鲜组织样本的所有实验操作B3.1-B3.8；

C、建立大量扩增肺癌病人肺原代上皮细胞和肺原代肿瘤细胞的传代培养：

C1、试剂配制：配备DMEM培养基、HBSS缓冲溶液、0.25%胰蛋白酶/EDTA等，用HBSS缓冲溶液与0.25%胰蛋白酶/EDTA配制成0.05%胰蛋白酶/EDTA，PBS缓冲溶液与胎牛血清以9:1的体积比配制成10%的消化终止液；

C2、当细胞培养瓶中培养的人肺原代上皮细胞和肺原代肿瘤细胞增殖至70-90%丰度时，用1X PBS缓冲液洗涤细胞两次，再用0.05%胰酶/EDTA消化单层细胞2-5分钟；

C3、含10%FBS的DMEM培养基中和消化反应，1000prm低速离心3-4分钟去除上清；

C4、以1:2，1:3，1:4或1:5比例分别重悬正常细胞沉淀和肿瘤细胞沉淀于培养基M中接种培养，比例的选择只要维持细胞贴壁和正常生长即可。