[发明专利]一种大鼠纤维化肺细胞的培养方法及其检测方法

说明书

本发明公开了一种大鼠纤维化肺细胞的培养方法及其检测方法，先配制培养液、灌注液和清洗液，然后对大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞进行取材和原代培养，然后用胺碘酮刺激Ⅱ型肺泡上皮细胞得到纤维化肺细胞，并对纤维化肺细胞进行了检测，本发明培养方法能在短时间内获取大量细胞，能够准确反映体内胺碘酮诱导肺纤维化情况，深入研究Ⅱ型肺泡上皮细胞表型转化调控及机制对延缓乃至逆转胺碘酮诱导的肺纤维化来说意义重大，为从细胞和分子水平进一步探索胺碘酮诱导肺纤维化机制的发病机制提供研究客体。

技术领域

本发明涉及医学领域，更具体的说是涉及一种大鼠纤维化肺细胞的培养方法及其检测方法。

背景技术

胺碘酮又称乙胺碘呋酮，是含碘苯丙呋喃衍生物，作为Ⅲ类抗心律失常药物广泛应用于临床，主要用于治疗室性心律失常和心房颤动。其副作用主要表现为肺毒性、甲状腺毒性、心脏毒性、消化系统毒性等，其中肺毒性反应最为严重，其发生率在1％-10％，肺毒性主要表现为肺纤维化，因发病机制不明，临床缺乏有效治疗措施，其死亡率高达33％，严重影响人民生命健康。但胺碘酮在抗心律失常方面疗效确切、稳定，目前尚无其他类似药物替代，在临床上应用仍十分广泛。因此，阐明胺碘酮诱导肺纤维化机制对降低其药物毒副作用，逆转或延缓肺纤维化进程、改善患者预后、提高生存率有重要的临床意义。

肺纤维化的病理生理过程与机制非常复杂，发病过程主要为组织损伤、新组织生成、组织重塑，最后肺内出现成纤维细胞灶和细胞外基质的异常沉积为主要特征的肺纤维化。成纤维细胞灶的形成是肺纤维化的重要病理特征，其中以肌成纤维细胞为主要效应细胞。目前EMT被认为可能是肌成纤维细胞形成的主要途径之一，由于正常肺内肌成纤维细胞数量不多，肺纤维化中约33％的肌成纤维细胞是由Ⅱ型肺泡上皮细胞通过EMT途径转化而来。因此，深入研究Ⅱ型肺泡上皮细胞表型转化调控及机制对延缓乃至逆转胺碘酮诱导的肺纤维化来说意义重大。因此制备体外细胞模型，从细胞和分子水平进一步探索胺碘酮诱导肺纤维化机制的发病机制，对其治疗的突破至关重要。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种大鼠纤维化肺细胞的培养方法及其检测方法，从分子水平制备胺碘酮诱导肺纤维化细胞，其能够准确反映体内胺碘酮诱导肺纤维化情况。

为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：一种大鼠纤维化肺细胞的培养方法及其检测方法，包括以下步骤：

步骤一、培养基、灌注液和清洗液的配制：配制DMEM培养基，再加入终浓度100ml/L胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素；配制灌注液，用PBS配制成质量分数0.1％的胰蛋白酶，再加入终浓度100U/ml青霉素、100U/ml链霉素和质量分数0.02％的EDTA，然后过滤除菌得到灌注液；配制PBS清洗液，再加入终浓度100U/ml青霉素和100U/ml链霉素；

步骤二、取材：大鼠腹腔内注射麻醉药进行麻醉，腹腔注射肝素钠2800-3000U，将大鼠处死后打开胸腔，用清洗液经右心室肺动脉洗去血液，然后取出肺，用灌注液灌注肺泡腔，放在37℃振动水浴中孵育10-30min，去除气管、大气道和心脏，在含有DNA酶Ⅰ的培养皿中将肺切成1-3mm³的碎块，往培养皿中加入3-6ml小牛血清灭活酶，将样品离心5-10min，弃上清液，将沉淀物用清洗液重悬，加入37℃预温的红细胞裂解液，反复吹打混匀，室温放置5-8min，使红细胞完全裂解，将样品离心5-10min，弃上清液，将沉淀物在37℃培养基中重悬并计数；