[发明专利]一种大鼠纤维化肺细胞的培养方法及其检测方法

权利要求书

1.一种大鼠纤维化肺细胞的培养方法及其检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤一、培养基、灌注液和清洗液的配制：配制DMEM培养基，再加入终浓度100ml/L胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素；配制灌注液，用PBS配制成质量分数0.1％的胰蛋白酶，再加入终浓度100U/ml青霉素、100U/ml链霉素和质量分数0.02％的EDTA，然后过滤除菌得到灌注液；配制PBS清洗液，再加入终浓度100U/ml青霉素和100U/ml链霉素；

步骤二、取材：大鼠腹腔内注射麻醉药进行麻醉，腹腔注射肝素钠2800-3000U，将大鼠处死后打开胸腔，用清洗液经右心室肺动脉洗去血液，然后取出肺，用灌注液灌注肺泡腔，放在37℃振动水浴中孵育10-30min，去除气管、大气道和心脏，在含有DNA酶Ⅰ的培养皿中将肺切成1-3mm3的碎块，往培养皿中加入3-6ml小牛血清灭活酶，将样品离心5-10min，弃上清液，将沉淀物用清洗液重悬，加入37℃预温的红细胞裂解液，反复吹打混匀，室温放置5-8min，使红细胞完全裂解，将样品离心5-10min，弃上清液，将沉淀物在37℃培养基中重悬并计数；

步骤三、原代培养：将取材得到细胞接种在DMEM培养基中，置于37℃、5％CO2培养箱内孵育40-60min，将未贴壁的细胞吸出，将样品离心5-10min，取下层沉淀，并接种于DMEM培养基中，如此反复3-4次，吸出未贴壁细胞，然后将悬液接种入已用大鼠IgG包被的培养皿中，置于37℃、5％CO2培养箱内孵育1-2h，收集未黏附游离细胞的混悬液，将样品离心5-10min，弃上清液，将细胞种植于细胞培养板中，每孔0.6-1ml，于37℃细胞培养箱中培养，24h后以原代细胞进行实验研究；

步骤四、胺碘酮致纤维化肺细胞的培养：将胺碘酮加入无血清培养基DMEM配成胺碘酮终浓度为10-180umolg/L的培养基，向含有胺碘酮的培养基中加入终浓度为5-10μM的1-磷酸鞘氨醇，加入终浓度为1-5μM的激动剂SEW2871,加入终浓度为0.1-0.5μM的二氢辣椒碱,于4-6℃储存；将培养基更换为含有不同浓度的胺碘酮的新鲜培养基，将细胞培养板置于37℃细胞培养箱中进行培养；

步骤五、检测：向上述培养板每孔中加入CCK8试剂，加完试剂后轻轻敲击培养板混匀CCK8检测液；将加入CCK8检测液的培养板再次置于37℃细胞培养箱中培养1-2小时；取出培养板，使用酶标仪在波长为450nm的条件下测定吸光度。

2.根据权利要求1任一项所述的一种大鼠纤维化肺细胞的培养方法及其检测方法，其特征在于：所述步骤二中通过注射3％戊巴比妥0.2-0.3ml/100g对大鼠进行麻醉。

3.根据权利要求2所述的一种大鼠纤维化肺细胞的培养方法及其检测方法，其特征在于：所述步骤二中重悬的沉淀物和红细胞裂解液的体积比为1∶8。

4.根据权利要求3所述的一种大鼠纤维化肺细胞的培养方法及其检测方法，其特征在于：在所述步骤二中用灌注液灌注肺泡腔后，放在37℃振动水浴中孵育10min，更换新的灌注液，再次孵育10min，在孵育过程中用手不断按摩肺脏。