[发明专利]基于CHO细胞表达系统的重组猪瘟E2蛋白的纯化方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及到从CHO细胞表达重组蛋白的培养液中分离纯化重组蛋白的方法，特别是从CHO细胞表达重组猪瘟E2蛋白的培养液中分离纯化重组猪瘟E2蛋白的方法，属于生物医药提取技术领域。

背景技术

猪瘟在欧洲称为古典猪瘟(Classical Swine Fever,CSF)是由猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus,CSFV)引起的一种急性、热性、致死性疾病。猪瘟具有高度接触传染性、发病急、高热稽留和小血管壁变性引起广泛出血、梗塞和坏死等病变特征。家养和野生猪是其唯一的天然宿主。世界动物卫生组织(OIE)将其定为A类传染病，我国《动物防疫法》将其列为一类传染病。猪瘟是目前危害我国养猪业发展的主要疫病之一。

猪瘟病毒属于黄病毒科、瘟病毒属成员，为单链线状RNA病毒。病毒粒子略呈圆形，具有脂蛋白囊膜，病毒粒子表面有脆弱的纤突结构。CSFV基因组长约12.5kb，仅含有1个大的开放性阅读框(ORF)，此ORF编码约3898个氨基酸残基、分子量约438kDa的多聚蛋白。此多聚蛋白在翻译的同时和在翻译后经病毒与宿主细胞蛋白酶加工成12种成熟蛋白，其中C,Erns,E1和E2为结构蛋白,其余为非结构蛋白。而E2是CSFV最主要的免疫原性蛋白，能够诱导机体产生中和抗体并且能够保护猪抵抗CSFV强毒株的攻击，也是研究猪瘟基因工程疫苗的重要靶蛋白。

膜过滤是生命科学实验室广泛使用的分离技术之一，根据膜的孔隙度，可分为微滤和超滤两种。微滤膜孔径一般是0.1-10μm，常应用于澄清、灭菌、微粒的去除和细胞的收获。超滤膜的孔径一般是0.001-0.1μm，常应用于可溶性分子(如蛋白质、多肽、核酸及其它生物分子)的脱盐、浓缩、以及缓冲液置换和分馏操作，超滤膜的规格一般采用截留分子量(MWCO)来区分。

微滤和超滤主要有两种过滤模式：(1)直流过滤(DFF)，也称为“死端”过滤，过滤时进样液流垂直于膜表面，液体100％通过膜；(2)切向流过滤(TFF)，也称为错流过滤，过滤时进样液流平行于膜表面，一部分料液通过膜(滤液)，剩余料液(回流液)循环回到进样容器。在DFF中，随着过滤的持续进行，大分子逐渐聚集在膜表面，并堵塞膜孔，从而降低过滤通量，即使增加压力，也只能将聚积层压紧，并不能改善过滤状态。而在TFF中，沿膜表面流动的料液会将膜表面由于浓差极化而形成的凝胶层“扫掠”清除，从而维持膜的过滤状态，保证小分子的通过。因此，相比DFF，TFF更加快速、高效和进一步直线放大

切向流过滤是生物分子分离和纯化的简单、快速、高效的技术之一。TFF可应用于样品的浓缩或脱盐过程，处理量可从几毫升到数千升不等，也可以应用于去除溶液中的内毒素和病毒颗粒、从小分子中分馏大分子、收获细胞悬液、澄清发酵液或细胞裂解液等。选择合适的TFF设备和操作条件必需优化和明确工艺的要求及参数，一旦工艺建立好，可以直线放大工艺，且只需调整膜、设备和流路即可用于处理大多数的相似产品的应用。

本实验室在申请号为201610625392.X的发明专利申请中首次使用CHO表达系统表达重组猪瘟E2蛋白，但在此专利中蛋白纯化使用的依旧是传统的方法，即镍柱纯化后超滤换液，虽然该方法纯化后的蛋白纯度能达到95％，但是该方法在处理细胞培养液时需要离心且后续还需要挂柱和换液，因此在工艺放大方面比较困难且成本很大(不仅需要购置大量大型的离心机和大型的AKTA和镍柱纯化设备，还需要大量的超滤浓缩设备且在洗脱换液后容易残留咪唑等化学分子)，不利于产品的产业化生产和销售(成本高价格相对较高，产品竞争力相对较低)，因此需要开发一种便于放大、成本较低、得率高、纯度较高且可大规模工业化生产的新的纯化方法，以满足工业放大和以后工业化生产的需求。

发明内容

本发明要解决的技术问题是开发一种便于放大、成本较低、得率高、纯度较高且可大规模工业化纯化CHO系统表达的猪瘟E2蛋白的方法，从而满足猪瘟重组E2蛋白亚单位疫苗工业化生产的需求。

本发明提供了一种基于CHO细胞表达系统的重组猪瘟E2蛋白的纯化方法，该方法包括以下步骤：(1)利用flux仪器以及中空纤维柱澄清CHO细胞培养液，以除去细胞和细胞碎片；(2)利用flux仪器以及中空纤维柱将(1)中澄清后的细胞培养液进行切向流过滤处理，以除去杂质后得到纯化后的重组猪瘟E2蛋白。

本发明的技术方案中，优选地，澄清CHO细胞培养液时的中空纤维柱是0.2μm中空纤维柱。