[发明专利]尿液中褪黑素硫酸盐的检测方法

权利要求书

1.一种尿液中褪黑素硫酸盐的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

样品前处理：取尿液样品，加入去离子水稀释，所述尿液样品与所述去离子水的体积比为1:1-2；然后加入内标液，所述尿液样品与所述内标液的体积比为1:1-3，得待测样品；

富集、分离和检测：对所述待测样品采用二维液相色谱串联四级杆质谱联用仪进行富集、分离和检测；

所述富集、分离和检测的步骤包括：

先用流动相1洗脱富集柱中的所述待测样品，对所述待测样品进行富集、纯化；

将富集柱与分析柱连通，用流动相2将待测物从富集柱洗脱至分析柱，用流动相2将待测物从分析柱洗脱、分离；

断开富集柱与分析柱，用流动相2将待测物从分析柱洗脱、分离至四级杆质谱进行检测；

其中，富集柱为C8柱，分析柱为C18柱；

流动相1：A相为乙腈，B相为水，流速为1.0-2.0ml/min；

流动相2：C相为含0.09-0.3wt％甲酸的乙腈，D相为含0.09-0.2wt％甲酸和5-10mM醋酸铵的水，流速为0.2-1.0ml/min；

流动相采用梯度洗脱模式，所述梯度洗脱模式为：

0min时，通入流动相1淋洗富集柱，对富集柱中的待测样品进行富集、纯化，流动相1中A相与B相的体积比为100:0；

0.25min时，将富集柱与分析柱连通，用流动相2将待测物从富集柱洗脱至分析柱，流动相2中C相与D相的体积比为98:2；

0.3min时，流动相2中C相与D相的体积比为70:30；

0.3min-0.5min时，流动相2中C相与D相的体积比由70:30变化至50:50；

0.8min时，断开富集柱与分析柱，用流动相2将待测物从分析柱洗脱、分离至四级杆质谱进行检测，流动相2中C相与D相的体积比为50:50；用流动相1将富集柱中的残留杂质洗脱至废液瓶中；

1.6min时，流动相2中C相与D相的体积比为50:50；

1.6min-3.0min时，流动相2中C相与D相的体积比由50:50变化至37:63；

3.1min时，流动相2中C相与D相的体积比为5:95；

3.7min时，流动相2中C相与D相的体积比为98:2；

整个梯度时间为4.5-7.0min。

2.根据权利要求1所述的尿液中褪黑素硫酸盐的检测方法，其特征在于，所述流动相1的流速为1.2-1.3ml/min，所述流动相2的流速为0.4-0.6ml/min。

3.根据权利要求1或2所述的尿液中褪黑素硫酸盐的检测方法，其特征在于，所述内标液为含10-50μg/L内标物的乙腈溶液；所述内标物为褪黑素的C¹³标记物或氘代标记物。

4.根据权利要求1或2所述的尿液中褪黑素硫酸盐的检测方法，其特征在于，所述四级杆质谱条件为：正离子模式，扫描方式为多反应监测离子扫描MRM；

所述正离子模式中，目标定量离子对包括褪黑素D4定量离子对和/或褪黑素硫酸盐定量离子对；

目标定量离子的多反应监测离子扫描MRM的质/荷比条件包括：褪黑素硫酸盐的母离子的质/荷比为328.9-329.5，对应的子离子的质/荷比为189-191；褪黑素D4的母离子的质/荷比为236.8-237.5，对应的子离子的质/荷比为177.8-178.5。

5.根据权利要求4所述的尿液中褪黑素硫酸盐的检测方法，其特征在于，所述四级杆质谱条件还包括以下离子源参数：

电离源为电喷雾电离ESI源，气帘气压力为35-45psi，加热气压力为35-45psi，辅助加热气压力为55-65psi，加热气温度为450-550℃，碰撞气为氮气，碰撞气压力为6.0-8.0psi，电喷雾针电压为5000-6000V。