[发明专利]一种异育银鲫抗CyHV-2口服重组芽孢疫苗及其制备方法

说明书

本发明涉及一种异育银鲫抗鲤疱疹病毒II型(CyHV‑2)口服重组枯草芽孢杆菌芽孢疫苗及其制备方法。该疫苗是用异育银鲫颗粒饲料包被表面展示CyHV‑2免疫保护性抗原的重组枯草芽孢杆菌芽孢CyHV‑2而制得；所述芽孢是具有萌发缺陷、无抗生素抗性基因标记的芽孢。其制备方法是构建萌发缺陷、无抗生素抗性基因标记和表面展示CyHV‑2免疫保护性抗原的重组枯草芽孢杆菌芽孢，制备异育银鲫颗粒饲料包被重组芽孢的CyHV‑2口服重组芽孢疫苗，用于CyHV‑2引起的异育银鲫出血病的防治。本发明制备萌发缺陷、无抗生素抗性基因标记的表面展示CyHV‑2保护性抗原的口服重组芽孢疫苗，具有更安全和高效的特点和优势。

技术领域

本发明属于水生动物口服疫苗领域。涉及萌发缺陷、无抗生素抗性基因标记的表面展示CyHV-2保护性抗原的口服重组芽孢疫苗及其制备方法。

背景技术

疱疹病毒II型(CyHV-2)是异育银鲫造血器官坏死病的病原体，传染性强、致死率高(90％以上)、流行范围广[1]。CyHV-2为双链DNA病毒，基因组大小为290,304bp，编码150个病毒蛋白[2]。其中，基因orf25,orf25B和orf146编码病毒囊膜蛋白，与其他病毒囊膜蛋白一样能诱导宿主动物产生特异性的免疫保护作用[2]。CyHV-2导致的异育银鲫造血器官坏死病目前还没有有效的治疗药物。疫苗免疫接种是诱导动物产生获得性免疫、预防控制病毒感染最有效的措施。研制安全高效的病毒疫苗对控制异育银鲫疱疹病毒病具有重要的应用价值。

已有大量关于鱼类口服或注射接种重组蛋白疫苗、DNA疫苗、减毒活疫苗的研究[3,4]。注射接种抗原疫苗保护效果最好，但难以大规模应用于水生动物疾病的控制。口服疫苗便于操作，但抗原在水体环境中的稳定性差、利用率低，易被消化道内的蛋白酶所降解、耐受性差，免疫保护效果不佳[3,4]。口服减毒活疫苗接种操作简便，但存在回复突变产生致病性的巨大风险。因此，安全高效的疫苗载体是保证水生动物口服疫苗免疫效果的关键。具有独特抗逆性、对动物具有益生功能和良好安全记录的枯草芽孢杆菌芽孢，已被证明是一种理想的口服蛋白抗原载体

枯草芽孢杆菌在营养缺乏时以处于休眠状态的芽孢存在。芽孢具有耐受高温、干燥、化学药物、酸碱的能力，在极端环境中能长期存活，并且能通过动物消化道屏障。枯草芽孢杆菌芽孢对动物具有益生功能，作为人类食品和动物饲料的添加剂被广泛应用，具有良好安全记录。一些枯草芽孢杆菌已建立了可操作的遗传系统，其芽孢的结构、分化及萌发过程已阐明。芽孢由20余种蛋白构成的外层衣壳包围，如cotA、cotB、cotC、cotF和cotG等，但这些衣壳蛋白基因缺失或突变不会导致芽孢特性的明显改变[5]。基于芽孢的以上特征，利用基因重组技术使芽孢衣壳蛋白与外源蛋白融合表达，并通过芽孢衣壳蛋白将外源蛋白展示在芽孢表面，建立了芽孢表面展示技术。利用该技术构建的重组芽孢在通过动物消化道时，被展示在芽孢表面的外源蛋白抗原能诱导动物产生系统和局部保护性免疫反应[6-8]。

但口服重组芽孢疫苗的保护效果有待提高。其主要原因传统芽孢表面展示技术制备的重组芽孢能在动物肠道中萌发形成营养细胞，导致丧失免疫诱导作用[9]。此外，重组芽孢中含有用于重组菌株筛选的抗生素抗性基因标记，存在一定的安全风险。

枯草芽孢杆菌芽孢芽孢的萌发受一系列基因表达产物调控，如gerA，gerB及gerK操纵子基因等。因此，当这些基因的缺失或突变时，枯草芽孢杆菌芽孢不能萌发形成营养细胞，称为萌发缺陷的芽孢[10]。此外，枯草芽孢杆菌细胞中含有位点特异的重组酶Xer，能识别并切割特异性的核苷酸序列[11]。Xer酶对染色体上特异序列识别并切割，并导致基因切除重组。

本发明的目的是利用基因重组技术，制备萌发缺陷、无抗生素抗性基因标记的表面展示CyHV-2保护性抗原的口服重组芽孢疫苗。

文献