[发明专利]一种异育银鲫抗CyHV-2口服重组芽孢疫苗及其制备方法

权利要求书

1.一种异育银鲫抗CyHV-2口服重组芽孢疫苗，其特征在于，是用异育银鲫颗粒饲料包被表面展示CyHV-2免疫保护性抗原的重组枯草芽孢杆菌芽孢CyHV-2而制得；所述芽孢是具有萌发缺陷、无抗生素抗性基因标记的芽孢；且重组枯草芽孢杆菌芽孢通过下述步骤制备：(1)构建重组载体：构建含枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白与CyHV-2免疫保护性抗原融合表达的重组基因、两侧有枯草芽孢杆菌位点特异的重组酶Xer识别和切割序列的抗生素抗性基因、以及以控制芽孢萌发的关键基因为整合片段的重组载体；所述枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白选自CotB、CotC、CotE、CotG、CotX，CyHV-2保护性抗原选自ORF25B、ORF25，所述控制芽孢萌发关键基因选自gerA、gerB和gerK操纵子，所述枯草芽孢杆菌位点特异的重组酶Xer识别和切割序列是如SEQ ID NO.25所示的nif序列；(2)将重组载体转化枯草芽孢杆菌，通过同源重组将融合表达的重组基因整合于染色体中并使芽孢萌发基因插入失活，并通过切除重组和负筛选获得无抗生素抗性基因的重组菌株；(3)诱导重组菌株细胞产生萌发缺陷、无抗生素抗性基因标记以及表面展示CyHV-2免疫保护性抗原的重组芽孢。

2.一种异育银鲫抗CyHV-2口服重组芽孢疫苗的制备方法，其特征在于，是用异育银鲫颗粒饲料包被表面展示CyHV-2免疫保护性抗原的、具有萌发缺陷、无抗生素抗性基因标记的重组枯草芽孢杆菌芽孢而制得；所述重组枯草芽孢杆菌芽孢通过下述步骤制备：(1)构建重组载体：构建含枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白与CyHV-2免疫保护性抗原融合表达的重组基因、两侧有枯草芽孢杆菌位点特异的重组酶Xer识别和切割序列的抗生素抗性基因、以及以控制芽孢萌发的关键基因为整合片段的重组载体；所述枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白选自CotB、CotC、CotE、CotG、CotX，CyHV-2保护性抗原选自ORF25B、ORF25，所述控制芽孢萌发关键基因选自gerA、gerB和gerK操纵子，所述枯草芽孢杆菌位点特异的重组酶Xer识别和切割序列是如SEQ ID NO.25所示的nif序列；(2)将重组载体转化枯草芽孢杆菌，通过同源重组将融合表达的重组基因整合于染色体中并使芽孢萌发基因插入失活，并通过切除重组和负筛选获得无抗生素抗性基因的重组菌株；(3)诱导重组菌株细胞产生萌发缺陷、无抗生素抗性基因标记以及表面展示CyHV-2免疫保护性抗原的重组芽孢。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述抗生素抗性基因指能用于枯草芽孢杆菌重组菌株细胞筛选的基因。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，枯草芽孢杆菌重组菌株是整合性重组载体转化枯草芽孢杆菌，并依次通过正筛选和负筛选后得到的菌株。

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，枯草芽孢杆菌包括能被整合性重组质粒转化、有位点特异的重组酶Xer的产芽孢菌株。

6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌是Bacillus subtilisstr.168及其衍生菌株。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，将重组芽孢与未经油脂喷涂的异育银鲫颗粒饲料均匀混合、吸附，以一定比例的植物油脂进行包被。