[发明专利]一种同时敲除KRAS基因和EGFR基因的CRISPR-Cas9系统及其应用

说明书

本发明公开一种同时敲除KRAS基因和EGFR基因的CRISPR‑Cas9系统，包括特异性靶向KRAS基因的sgRNA，对应的DNA序列如SEQ ID NO.1或/和SEQ ID NO.2所示，和特异性靶向EGFR基因的sgRNA，对应的DNA序列如SEQ ID NO.11或/和SEQ ID NO.12所示。本发明还公开了其在制备治疗癌症药物中的应用。本发明CRISPR‑Cas9系统可同时高效敲除在肺癌中高度表达的两个癌症驱动因子KRAS及EGFR，该系统操作简单，敲除效率高，有望在肺癌的治疗中得到应用。本发明系统适用于EGFR和KRAS异常表达的多种癌症。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种同时敲除KRAS基因和EGFR基因的CRISPR-Cas9系统及其应用。

背景技术

肺癌是目前世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，全球肺癌的发病率和死亡率均呈上升趋势。在我国，随着工业化速度加快、环境污染严重及人口老龄化加剧，肺癌的癌症负担日益加重。根据病理组织学可将肺癌分为两大类：非小细胞肺癌(NSCLC，85％)和小细胞肺癌(SCLC，15％)，其治疗仍为医疗界最具挑战性的任务之一。

肿瘤细胞在驱动基因的作用下持续生长，并对驱动基因的抑制高度敏感，其中KRAS和EGFR是在肺癌中常见的突变驱动基因。

已发现三分之一NSCLC和KRAS基因突变直接相关，故针对KRAS突变的靶向治疗是近年来肺癌研究的热点。KRAS基因属RAS基因家族中的一员，编码蛋白P21，本质为一单聚体G蛋白，位于细胞膜内侧，通过与GTP/GDP结合来调节细胞生长、分化。正常状态下p21和GDP结合处于静止状态，当受到生长因子刺激时，p21被激活为GTP结合状态，信号系统开放，同时p21具有的GTP酶活性使GTP水解成为GDP，p21重新和GDP结合后失活，信号系统关闭。正常KRAS基因可抑制肿瘤生长，突变的KRAS蛋白p21仅有微弱的GTP活性，不能迅速分解GTP，因此RAS信号传导蛋白“锁密”在GTP结合的激活状态，使细胞得到持续生长信号的刺激，募集受体信号传播所需蛋白，传递细胞外信号，影响细胞的增殖、存活和分化等过程，持续刺激细胞生长，打乱生长规律，从而导致肿瘤发生。

表皮生长因子受体(EGFR)基因位于第7号染色体p13～q22区，由28个外显子组成，编码1186个氨基酸。该基因编码的是一种跨膜的蛋白受体，为EGFR家族成员之一。EGFR突变率在不同人种中存在显著差异。突变热点主要是在其酪氨酸激酶的编码区，大多数集中在18～21外显子，最常见的突变是位于19外显子的缺失突变(约占EGFR突变的44％)和位于21外显子的L858R点突变(约占EGFR突变的41％)。

表皮生长因子(EGF)是体外最强的促表皮细胞分裂因子，可以与某些细胞分泌的转化因子(TGFA)竞争性结合EGFR，而后激活受体酪氨酸蛋白激酶，后者使自身及胞浆中多种蛋白质底物磷酸化，触发一系列信号传递，将信息传至细胞核内，促进蛋白质和酶的合成及细胞的分裂增殖。人类的许多肿瘤都检测到EGFR表达，并通过自分泌、旁分泌作用促进肿瘤生长，肺癌中EGFR的表达量明显高于正常组织，表明其在肺癌的发生、发展中有着重要作用。

近年来，基因组编辑工具广泛应用于生物医学领域，而成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)技术已成为基因组编辑的热点。CRISPR是自然存在于细菌DNA中的序列，与CRISPR相关核酸酶(Cas)结合，具有指导RNAs保护细菌基因组免受侵入性噬菌体中检测到的靶向特异性序列攻击的作用。CRISPR/Cas9技术被Nature、Science杂志分别评为2013年前10位的明星技术之一，并位居2015年科学杂志评选出来的十大发现之首。该项技术将成为功能基因组学和系统生物学领域中强有力的研究工具。