[发明专利]一种硫代修饰引物及应用该引物的SNP检测方法

说明书

技术领域

本发明属于SNP检测技术领域，特别涉及一种硫代修饰引物及应用该引物的SNP检测方法。

背景技术

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP),主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种。占所有已知多态性的90％以上。SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500～1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。

目前SNP的常用检测方法是等位基因特异性PCR(Allele apecific PCR，AS-PCR)，AS-PCR是基于引物3`端碱基与DNA模板匹配与否来区分SNP位点。理论上，只要末位碱基不配对，那么引物无法有效延伸；但是末位单碱基错配往往不能达到预期的分辨效果。由于PCR反应中DNA呈指数级增长，当与引物3`端碱基错配的DNA模板在第一个循环有少量的扩增时，其复制出来的DNA模板在后续的循环里与原引物的错配就不存在。随着指数级的DNA扩增，错配产物的数量也相当可观。达到影响分辨率的程度。

授权公告号为CN103320514B的发明专利公开了一种检测临近SNP的多重PCR方法，可以解决扩增抑制问题并提高扩增效率；但是该方法需要设计多对引物，工作量较大，操作较为繁琐。因此，提供一种新的SNP检测方法，以提高灵敏性和准确性，防止错配延伸，成为本领域研究人员急需解决的技术问题。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种硫代修饰引物及应用该引物的SNP检测方法。

本发明具体技术方案如下：

本发明一方面提供了一种硫代修饰引物，所述引物的硫代修饰位点为3`端第一和第二个碱基之间的磷酸二酯键。

本发明另一方面提供了一种应用该引物的的SNP检测方法，包括如下步骤：

S1：设计并合成用于扩增目的基因的特异性引物，所述特异性引物包括两条上游引物F1、F2和一条下游引物R，所述F1引物和所述F2引物3`端第一位碱基不同，其余序列均相同；

S2：分别对所述F1引物和所述F2引物进行硫代修饰；

S3：用所述引物对目的基因进行PCR扩增；

S4：对实验结果进行分析。

进一步地，所述PCR的反应体系中使用的DNA聚合酶为Pfu高保真DNA聚合酶。

SNP位点的识别，即单个碱基的识别。高保真DNA聚合酶比普通Taq DNA聚合酶对错配碱基的识别能力更强。但是高保真DNA聚合酶具有3`-5`核酸外切酶活性，在PCR的过程中会切掉不匹配的碱基；硫代修饰的作用是改变碱基间的连接方式，将碱基间磷酸二酯键中的氧原子换成硫原子，3`-5`核酸外切酶在PCR过程中不能识别该位点，从而不能将不匹配的碱基切除。由此可以提高SNP检测的特异性和准确性。

进一步地，所述步骤S3中，分别采用F1引物和F2引物为上游引物、以R引物为下游引物进行实时荧光定量PCR。

进一步地，所述PCR的反应体系中包括如下组分：

模板DNA 0.2ng/μl、F1引物或F2引物0.5μM、R引物0.5μM、dNTP 0.2mM、Pfu高保真DNA聚合酶0.02U/μl以及1×的SYBR GREEN。

不同种类生物的不同基因片段大小不同，差距可达两个数量级，用量约在0.02～2ng/μl之间。本研究中应用的是人基因组片段，因此模板用量为0.2ng/μl。

进一步地，所述PCR的反应条件如下：

(1)预变性：98℃ 3min；

(2)扩增：98℃ 10s，58℃ 30s，共40个循环；

(3)扩增曲线：95℃ 15s；60℃ 15s；95℃ 15s。

分别以两种上游引物进行扩增，当特异性引物与模板完全匹配时，引物可以正常延伸，产生扩增曲线；当特异性引物与模板不能匹配时，引物不能延伸，不能产生扩增曲线。由此，可以对模板中的SNP位点起到检测作用。

上述技术方案可以通过设计分子信标探针替代荧光染料，此时，所述步骤S3包括如下步骤：

S3.1：对目的基因通过AS-PCR进行位点识别；

S3.2：分子信标扩增：利用两条分子信标探针对步骤S3.1中得到的扩增产物进行PCR扩增；