[发明专利]一种硫代修饰引物及应用该引物的SNP检测方法

权利要求书

1.一种硫代修饰引物，其特征在于，所述引物的硫代修饰位点为3`端第一和第二个碱基之间的磷酸二酯键。

2.应用权利要求1所述的硫代修饰引物的SNP检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1：设计并合成用于扩增目的基因的特异性引物，所述特异性引物包括两条上游引物F1、F2和一条下游引物R，所述F1引物和所述F2引物3`端第一位碱基不同，其余序列均相同；

S2：分别对所述F1引物和所述F2引物进行硫代修饰；

S3：用所述引物对目的基因进行PCR扩增；

S4：对实验结果进行分析。

3.如权利要求2所述的SNP检测方法，其特征在于，所述PCR的反应体系中使用的DNA聚合酶为Pfu高保真DNA聚合酶。

4.如权利要求3所述的SNP检测方法，其特征在于，所述步骤S3中，分别采用F1引物和F2引物为上游引物、以R引物为下游引物进行实时荧光定量PCR。

5.如权利要求4所述的SNP检测方法，其特征在于，所述PCR的反应体系中包括如下组分：

模板DNA 0.2ng/μl、F1引物或F2引物0.5μM、R引物0.5μM、dNTP0.2mM、Pfu高保真DNA聚合酶0.02U/μl以及1×的SYBR GREEN。

6.如权利要求5所述的SNP检测方法，其特征在于，所述PCR的反应条件如下：

(1)预变性：98℃3min；

(2)扩增：98℃10s，58℃30s，共40个循环；

(3)扩增曲线：95℃15s；60℃15s；95℃15s。

7.如权利要求1所述的SNP检测方法，其特征在于，所述步骤S3包括如下步骤：

S3.1：对目的基因通过AS-PCR进行位点识别；

S3.2：分子信标扩增：利用两条分子信标探针对步骤S3.1中得到的扩增产物进行PCR扩增；

S3.3：信号产生：将反向引物结合到步骤S3.2中得到的扩增产物上，进行PCR扩增，使分子信标的荧光基团和淬灭基团分开，从而产生信号。

8.如权利要求7所述的SNP检测方法，其特征在于，所述F1引物的5`端连接有通用标签1，所述F2引物的5`端连接有通用标签2，所述通用标签1和所述通用标签2的碱基序列如下：

通用标签1：5`GAAGGTGACCAAGTTCATGCT 3`；

通用标签2：5`GAAGGTCGGAGTCAACGGATT 3`。

9.如权利要求8所述的SNP检测方法，其特征在于，两条所述分子信标探针的3`端引物序列分别与通用标签1和通用标签2的序列相同，5`端分别标记FAM和HEX作为荧光基团，中间均标记Dabcyl作为淬灭基团。

10.如权利要求9所述的SNP检测方法，其特征在于，所述步骤S3中PCR反应体系中包括如下成分：

模板DNA 0.2ng/μl、F1引物0.5μM、F2引物0.5μM、R引物0.5μM、分子信标beacon-FAM 0.5μM、分子信标beacon-HEX 0.5μM、dNTP 0.2mM以及Taq DNA聚合酶0.02U/μl；

所述PCR的反应条件如下：

(1)预变性：94℃5min；

(2)扩增：94℃20s，58℃30s，共36个循环。