[发明专利]一种基于硫磺素T的免疫分析方法

说明书

本发明提供了一种基于硫磺素T的免疫分析方法及其应用，该方法在传统碱性磷酸酶反应体系ELISA的基础上，加入酶响应的多肽作为反应底物，多肽在酶催化下形成的β‑折叠结构，随后引入荧光染料硫磺素T，利用硫磺素T与β‑折叠多肽结合产生的信号进行检测，提供了五种读出模式用于检测肺炎支原体抗体，显示了更多的选择性，提供了一种检测肺炎支原体IgM抗体的优越方法。

技术领域

本发明涉及免疫测定领域，具体涉及一种基于硫黄素T的多读出模式的免疫分析方法及其应用。

背景技术

多重读出模式比单种读出模式对于疾病诊断显示更加明显的优势。多种模式的读出不仅可以在各种资源有限的条件下更加灵活的报告疾病，还能通过验证不同的读数结果的一致性提高检测的可靠性。定性和定量双重分析显示更多的优势。定性分析协助对疾病的快速判断。定量分析提供准确和详细的数据报告疾病的进展情况。因此，开发一个多种读出的免疫测定分析是一个疾病诊断领域有吸引力的研究方向。多肽自组装结合荧光染料为我们开发多信号免疫测定分析提供了可能性。近年来多肽作为各种生理信号生物传感器，受到越来越多的关注，由于其水溶性好、成本低、合成方便、无污染，显示良好的应用前景。

肺炎支原体是引起肺炎较常见的病原体，引起严重的呼吸道感染和神经系统损害，儿童和青少年多发。从患者标本中分离出肺炎支原体是诊断感染的可靠标准，但常规培养需要10～14天，甚至更长时间，对早期诊断价值不大。特异性的血清学检查方法主要有被动凝集试验和酶联免疫吸附试验(ELISA)，在恢复期或急性期抗体浓度成倍增高或见底可协助诊断肺炎支原体感染。

由于肺炎支原体感染临床症状不典型，缺乏特异性，不易与其他细菌、病毒等感染鉴别，易误诊。传统培养法检测肺炎支原体需2周以上，耗时长且检出率较低，不能及时指导临床用药。肺炎支原体感染后，可刺激机体产生IgM和IgG抗体，通过检测血清中的特异性抗体可以辅助诊断支原体感染，IgM型抗体在感染早期即可出现，短时间内其浓度成倍升高对支原体感染的诊断有重要意义。

发明内容

因此，本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种具有多读出模式的免疫分析方法，从定性和定量两方面进行检测，比传统方法显示更多的优势。

在阐述本发明的技术方案之前，定义本文中所使用的术语如下：

术语“IgM”是指：免疫球蛋白M。

术语“IgG”是指：免疫球蛋白G。

术语“MP”是指：肺炎支原体。

术语“Tris”是指：三羟甲基氨基甲烷。

术语“ELISA”是指：酶联免疫吸附测定。

术语“ALP”是指：碱式磷酸酶。

为实现上述目的，本发明的第一方面提供了一种基于硫磺素T的免疫分析方法，所述方法包括：使用碱性磷酸酶作为标记酶，使用多肽作为反应底物，将多肽前体与硫磺素T结合，通过检测所述硫磺素T的荧光来检测样本中肺炎支原体抗体MP-IgM的存在或浓度，所述多肽为如下(a)或(b)所述的多肽：(a)具有甘氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-酪氨酸的氨基酸序列，(b)将(a)中的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代，缺失或添加且可与所述硫磺素T结合的由(a)衍生的多肽。

优选地，根据本发明第一方面所述的基于硫磺素T的免疫分析方法，所述方法进一步包括：

(1)包被抗原：以相应的稀释浓度包被肺炎支原体菌体抗原于酶标板孔中，并封膜封板，静置；

(2)洗板：加入Tris-HCl洗涤液洗板，并翻转酶标板置于吸水纸上并滤去水分；

(3)封闭：加封闭液，室温封闭；

(4)洗板，重复步骤2；

(5)加入标准品和待测血清，室温孵育；