[发明专利]小麦光腥黑粉菌原生质体的制备方法

说明书

本发明涉及一种小麦光腥黑粉菌原生质体的制备方法，包括如下步骤：(1)菌丝培养：将小麦光腥黑粉菌的冬孢子在水琼脂培养基中培养6‑9天后，用灭菌蒸馏水冲洗下来，收集菌液，离心去上清，得到菌丝；(2)细胞壁裂解：以氯化钾溶液作为渗透压稳定剂，配制混合酶液，加入菌丝中，28℃振荡酶解1.5‑2.5h，即得到小麦光腥黑粉菌原生质体；所述混合酶液包括质量百分比浓度为1.5％的崩溃酶、1.5％的溶壁酶和1.5％的蜗牛酶。采用所述方法制备小麦光腥黑粉菌原生质体，产量高达17.0×10⁵～18.0×10⁵个/mL，且释放的原生质体均匀散乱分布，不聚集成堆。

技术领域

本发明涉及细胞工程中真菌原生质体制备与再生技术领域，具体涉及一种小麦光腥黑粉菌原生质体的制备方法。

背景技术

小麦光腥黑粉菌(Tilletia foetida Walle.Lindr.)引起的小麦光腥黑穗病(common bunt of wheat)是一种世界性病害，具有分布广泛、流行性强，危害严重等特点，严重影响小麦的生产。感病植株通常在外观上没有明显的症状，在发病后期，颖壳略向外张开，整个麦穗变成病穗，病粒外有一层灰色薄膜，内部充满黑粉，是病原菌的冬孢子，冬孢子有鱼腥味，引起小麦产量和品质降低。小麦光腥黑粉菌属于担子菌亚门(Basidiomycotina)、冬孢菌纲(Teliomycetes)、黑粉菌目(Ustilaginales)、腥黑粉菌科(Tilletiaceae)、腥黑粉菌属(Tilletia)。冬孢子呈褐色，球形或近球形，可随种子传播，在土壤中能够存活多年，一旦条件适宜并遇到大面积的寄主植物，便会引起发病。

国内外对于小麦光腥黑穗病的研究主要集中在病原菌生物学特性以及分子标记技术，对该病原菌的致病机制研究较少。遗传转化技术是实现大规模定点突变的重要方法，利用该技术能够改变真菌的遗传物质，研究植物病原菌的的致病机理。目前，真菌遗传转化的方法有很多，常见的有聚乙二醇介导的原生质体转化、限制性内切酶介导的整合以及农杆菌转化等。原生质体是大多数转化方法的受体细胞，因此原生质体的制备和再生直接关系到转化能否顺利进行。获得产率高、可再生的小麦光腥黑粉菌原生质体的制备方法，将为建立该病原菌的遗传转化体系奠定基础，推动对该病原菌致病机制的研究。

发明内容

针对上述领域存在的需求，本发明的目的在于提供一种小麦光腥黑粉菌原生质体的制备方法。

本发明通过如下技术方案实现：

小麦光腥黑粉菌原生质体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)菌丝培养：将小麦光腥黑粉菌的冬孢子在水琼脂培养基中培养6-9天后，用灭菌蒸馏水冲洗下来，收集菌液，离心去上清，得到菌丝；

(2)细胞壁裂解：以氯化钾溶液作为渗透压稳定剂，配制混合酶液，加入菌丝中，28℃振荡酶解1.5-2.5h，即得到小麦光腥黑粉菌原生质体；

所述混合酶液包括质量百分比浓度为1.5％的崩溃酶、1.5％的溶壁酶和1.5％的蜗牛酶。

优选地，所述水琼脂培养基的制备方法为：称取20g琼脂粉，加水定容到1L，高压蒸汽灭菌。

优选地，所述小麦光腥黑粉菌冬孢子在水琼脂培养基中培养7天。

优选地，所述氯化钾溶液的浓度为1.2mol/L。

优选地，所述28℃振荡酶解的时间为2h。

优选地，所述混合酶液与所述菌丝的配比为20ml：1g。

优选地，所述振荡酶解在180r/min的转速下进行。

优选地，所述小麦光腥黑粉菌的冬孢子在水琼脂培养基中培养的条件为温度为16℃和相对湿度为80％。