[发明专利]一种基于依赖解旋酶DNA恒温扩增技术检测microRNA的方法

说明书

本发明公开了一种基于依赖解旋酶DNA恒温扩增技术检测microRNA的方法，步骤如下：(1)提取样品中的总RNA；(2)向提取的总RNA中加入单链DNA探针和过量的核酸外切酶I，在反应缓冲液中进行孵育，实现目标microRNA与单链DNA探针的特异性结合，利用过量的核酸外切酶I将多余的单链DNA探针消除；(3)向步骤(2)的反应体系中加入上游引物、下游引物、单链结合蛋白和解旋酶，对目标microRNA进行扩增反应，通过荧光信号检测目标microRNA的表达。本发明借助核酸外切酶I的消化以降低背景、利用解旋酶辅助的恒温扩增(HDA)反应以放大信号，实现了对microRNA的快速和高灵敏检测。

技术领域

本发明涉及生物分析技术领域，特别是涉及一种基于依赖解旋酶DNA恒温扩增技术检测microRNA的方法。

背景技术

microRNA是近年来在多种真核细胞及病毒中发现的一类内源性非编码单链RNA，长度为21～25nt的短序列，在进化上具有高度的保守性，能够通过与靶mRNA特异性的碱基互补配对，引起靶mRNA降解或者抑制其翻译，从而对基因进行转录后的表达调控。由于microRNA序列在不同的生物中具有一定的保守性，目前普遍认为microRNA的功能是参与生命的一些基本过程，如发育过程中的细胞增殖、细胞死亡、应激反应和脂肪代谢等。

因此，microRNA被认为是一种潜在的生物标志物，实现microRNA的选择性灵敏定量检测对于理解其生物功能和临床应用都具有很重要的价值。

由于microRNA分子只有21～25nt左右大小，检测较为困难。现有的检测方法中，核酸印迹分析作为microRNA分析的标准方法，但该方法存在着灵敏度较低(高于1纳摩尔每升)、操作耗时以及样品消耗量大等缺点，因此该方法并不适于低丰度microRNA的分析测定。

为了提高检测灵敏度，基于聚合酶链式反应(PCR)和恒温核酸扩增技术的microRNA检测方法逐渐发展起来。基于聚合酶链式反应(PCR)的方法实现了检出限的大幅降低(达到100飞摩尔每升左右)，但该方法所必需的反转录环节增加了探针设计的难度；此外，为了实现聚合酶链式反应(PCR)所需的精确温度循环过程，需要使用价格昂贵而操作复杂的热循环仪，这也限制了该方法的广泛应用。

滚环扩增(RCA)、环介导恒温扩增(LAMP)以及指数扩增反应(EXPAR)等恒温扩增技术的发展使得microRNA的检测可以在某一特定温度下进行，达到了较高的灵敏度，但大多数恒温扩增技术反应时间较长，反应机理较为复杂，难以满足临床检测的需求。例如，为了达到10飞摩尔每升的检出限，分支滚环扩增(RCA)需要长达8个小时的反应时间，而恒温指数扩增(EXPAR)需要设计带有限制性核酸内切酶特异性识别位点的核酸模板。

依赖解旋酶辅助的恒温扩增(HDA)技术是核酸等温扩增技术中的一种，该技术模拟自然界生物体内DNA复制的自然过程，在恒温条件下利用解旋酶解开DNA双链，同时DNA单链结合蛋白(SSB)稳定解开的单链为引物提供结合模板，然后由DNA聚合酶催化合成互补链。新合成的双链在解旋酶作用下又解成单链，并作为下一轮合成的模板进入上述循环扩增反应，最终实现靶序列的指数式增长。目前有关HDA检测方法的报道较少，相关研究主要是利用HDA技术对一些病原菌进行检测，但尚未见采用HDA方法检测microRNA的报道。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种基于依赖解旋酶DNA恒温扩增技术检测microRNA的方法。本发明将HDA技术引入到microRNA检测中，实现了对microRNA的超高灵敏检测。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种基于依赖解旋酶DNA恒温扩增技术检测microRNA的方法，步骤如下：

(1)提取样品中的总RNA；