[发明专利]一种基于依赖解旋酶DNA恒温扩增技术检测microRNA的方法

权利要求书

1.一种基于依赖解旋酶DNA恒温扩增技术检测microRNA的方法，其特征在于，步骤如下：

(1)提取样品中的总RNA；

(2)向提取的总RNA中加入单链DNA探针和过量的核酸外切酶I，在反应缓冲液中进行孵育，实现目标microRNA与单链DNA探针的特异性结合，利用过量的核酸外切酶I将多余的单链DNA探针消除；

(3)向步骤(2)的反应体系中加入上游引物、下游引物、单链结合蛋白和解旋酶，对目标microRNA进行扩增反应，通过荧光信号检测目标microRNA的表达；

所述单链DNA探针中包含HDA扩增的模板序列，并且所述单链DNA探针的3’末端与待检测的目标microRNA完全互补；所述上游引物与单链DNA探针的3’端互补；所述下游引物与单链DNA探针的5’端一致，可保证HDA扩增反应的进行。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，提取样品中的总RNA采用的方法为：利用总RNA提取试剂盒对样品中的RNA进行抽提与纯化。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述反应缓冲液中含有：1毫摩尔每升的二硫苏糖醇、1×核酸外切酶I反应缓冲液、20个单位的RNA酶抑制剂、10毫摩尔每升的氯化钠以及10毫摩尔每升的pH 8.0的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，孵育的温度为95℃，孵育的时间为5min。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，扩增反应的温度为60-70℃，扩增反应的时间为30min。

6.一种检测microRNA的试剂盒，其特征在于，包括：单链DNA探针、上游引物和下游引物、核酸外切酶I、单链结合蛋白和解旋酶；

所述单链DNA探针中包含HDA扩增的模板序列，并且所述单链DNA探针的3’末端与待检测的目标microRNA完全互补；

所述上游引物与单链DNA探针的3’端互补；所述下游引物与单链DNA探针的5’端一致。

7.一种检测miR-21的试剂盒，包括：单链DNA探针、上游引物、下游引物、核酸外切酶I、单链结合蛋白和解旋酶；

所述单链DNA探针的序列如SEQ ID NO.1所示；所述上游引物和下游引物的序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

8.权利要求6所述的试剂盒在非疾病的诊断目的的检测microRNA中的用途。