[发明专利]一种二氢硫辛酸脱氢酶LPD的表达和纯化方法

说明书

本发明公开了一种二氢硫辛酸脱氢酶LPD的表达和纯化方法，属于蛋白分子的表达和纯化领域。本发明主要包括以下步骤:克隆大肠杆菌的lpdA基因；构建重组表达质粒并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中；通过抗性筛选，得到高水平表达的大肠杆菌转化子；转化子在摇瓶中扩大培养后，把破菌液上清用羟基磷灰石层析柱纯化得LPD蛋白。经SDS‑PAGE检测，LPD蛋白纯度达95％以上。本发明具有表达稳定、操作简便、成本低、效率高的优点，特别是通过此种方式获得的LPD蛋白不含任何的标签，很好地保持了目的蛋白的天然构象和活性，能为LPD蛋白研究提供优质材料。

技术领域

本发明涉及蛋白分子表达和纯化技术领域，特别涉及一种二氢硫辛酸脱氢酶LPD的表达和纯化方法。

背景技术

二氢硫辛酸脱氢酶E3（lipoate dehydrogenase lipoamide dehydrogenase，lpdA基因编码），即LPD，是大肠杆菌的丙酮酸脱氢酶复合体PDH（pyruvate dehydrogenasecomplex）的重要组成部分，它同丙酮酸脱羧酶E1（pyruvate decarboxylase，aceE基因编码)，硫辛酸乙酰转移酶E2 (lipoate transacetylase， aceF基因编码)共同构成一个大小约为4.6 MD的复合体蛋白。其核心单位由E2组成，核心外分别被E1和E3包裹，三者比例为24：24：12。其中E3－LPD主要催化以下反应：

丙酮酸脱氢酶复合体是生物体进行糖代谢的枢纽，其催化和活性调节过程非常复杂。真核生物中，丙酮酸脱氢酶PDH是通过磷酸化和去磷酸的的作用进行调节的，而在细菌特别是大肠杆菌中却截然不同：

首先aceEF-lpdA基因受到了pdhR操纵子在转录水平上调节： 当细胞内没有丙酮酸存在时，PDHR蛋白结合在pdhR的操作子区域，阻碍整个pdhR-aceEF-lpdA基因的转录。尽管lpdA基因也有自己的启动子，并且能够独立转录，但由于丙酮酸脱氢酶复合体PDH跟α-酮戊二酸脱氢酶复合体α-KDPG共用LPD蛋白，故被广泛认为是lpdA在进行单独转录和翻译时，LPD更多的是出于α-KDPG装配合成的目的。

再者，糖酵解过程中的中间化合如葡萄糖-6-P，果糖-1，6-P和甘油酸-3-P等对PDH的活性有正向调节作用，GTP（ATP）则对PDH的活性有抑制作用。此外，PDH的催化产物乙酰-CoA和NADH对PDH活性具有竞争性抑制作用，主要是表现为他们同酶的作用底物CoA和NAD^＋竞争活性部位，其中乙酰-CoA抑制E2，而E3：LPD则受到NADH的强烈抑制。越来越多的研究揭示，PDH特别是LPD的活性对细胞内NADH浓度特别敏感，当细胞内NADH浓度或者NADH/NAD^＋的比率增高时，LPD的活性会受到明显的抑制，反之，酶的活性则较高。研究显示，大肠杆菌好氧跟厌氧生长时体内的的NADH/NAD^＋比值约为0.19：0.34，也有人报道为0.03：0.70。因而在厌氧状态下，由于LPD活性受到了高浓度NADH的抑制，使得PDH虽然能够正常表达，但活性却受到抑制。最近，更有研究者发现，LPD某些氨基酸位点的改变，可使LPD乃至整个PDH复合体的酶学性质发生了改变，使得缺失厌氧生长途径的大肠杆菌出现了厌氧生长性状恢复。这说明LPD蛋白是大肠杆菌进行PDH活性调节的物质基础，LPD的变化将对整个PDH蛋白复合体的结构和功能产生重要的影响。研究LPD蛋白的结构生物学特征对于揭示LPD蛋白与E1和E2组分的乃至真个PDH蛋白相互作用机制将会有积极的推动意义。